عنوان پایان‌نامه
آنالیز میکروبی مخمرهای دستگاه گوارشی و بررسی وجود ژن های پروکاریوتی در آنها با روش مولکولی
- رشته تحصیلی
- زیست شناسی علوم میکروبیولوژی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه پردیس علوم شماره ثبت: 5055;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 58749
- تاریخ دفاع
- ۲۶ شهریور ۱۳۹۰
- دانشجو
- سحر وثوقیان
- چکیده
- مقدمه: مخمرها و باکتری ها در محیط های مختلفی از محصولات غذایی گرفته تا بدن انسان در کنار یکدیگر زندگی می کنند. این حضور مشترک می تواند منجر به وقوع برهمکنش های زیستی به ویژه رابطه درون همزیستی بین دو ارگانیسم شود. در این مطالعه امکان انجام ریز دست ورزی بر روی سلول مخمر به منظور مطالعه اجسام شبه باکتریایی درونی سلول مخمر بررسی شد. همچنین احتمال وجود رابطه همزیستی بین مخمر ساکن دستگاه گوارش (جنس Candida) و باکتری های گوارشی Proteus mirabilisو Helicobacter pylori آنالیز شد. روش ها: به منظور مطالعه امکان ریز دست ورزی سلول مخمر، ابعاد مخمر (با به کارگیری روش های شیمیایی شامل القاء تولید هیف توسط N- استیل گلوکز آمین و افزایش تدریجی غلظت اتانول در محیط کشت) تغییر یافت و نتایج توسط میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM) بررسی شد. DNA ژنومی نمونه مخمر روده ای و ? نمونه مخمر معده ای جنس Candida استخراج شد. واکنش PCR آشیانه ای (nested PCR) توسط پرایمرهای اختصاصی ژن اوره آز باکتری P. mirabilisو H. pylori بر روی نمونه های مخمری انجام شد. DNA باکتری P.mirabilis ، H. pyloriو DNA باکتری Staphylococcus aureus به ترتیب به عنوان نمونه های کنترل مثبت و کنترل منفی استفاده شدند. همچنین بیان ژن اوره آز باکتری H. pylori در مخمر spp. Candida در سطح رونویسی بررسی شد. نتایج: بررسی ابعاد سلول مخمر توسط سیستم AFMپس از انجام تیمارهای شیمیایی نشان داد که علیرغم افزایش اندازه سلول مخمر (طول و حجم) هنوز این اندازه برای انجام ریز دست ورزی مناسب نیست. محتوای ژنی هیچ یک از نمونه های مخمری توسط پرایمر اختصاصی ژن اوره آز باکتری P. mirabilis تکثیر نشد. اما % از نمونه های مخمر روده ای مورد بررسی حاوی ژن اوره آز ویژه باکتری H. pylori بودند. در همین شرایط در نمونه کنترل منفی قطعه ای تکثیر نشد. نتایج تعیین توالی محصولات PCR در حدود % شباهت را میان قطعه تکثیر شده از مخمر و ژن ureAB باکتری H. pylori نشان داد. نتایج بررسی بیان ژن اوره آز باکتری H. pylori در مخمر در سطح رونویسی حاکی از تکثیر قطعه مشابه نمونه کنترل مثبت در واکنش RT-PCR بود. این داده نیاز به بررسی های تکمیلی دارد. بحث: نتایج پژوهش نشان می دهد با وجود امکان وقوع رابطه همزیستی بین باکتری H. pylori و مخمر روده ای ارتباطی بین باکتری P. mirabilis و مخمر روده ای به عنوان ساکنین مشترک مجرای گوارشی وجود ندارد. به نظر می رسد شرایط محیطی و احتیاجات مخمر و باکتری در وقوع رابطه همزیستی نقش دارد. وجود چنین ارتباطاتی در تکامل و بیماریزایی دو ارگانیسم دارای اهمیت است. فعالیت اوره آز باکتری H. pylori برای بقاء داخل سلولی باکتری ضروری است. تعیین نقش اوره آز در روابط همزیستی بین مخمر و باکتری احتیاج به بررسی های بیشتری دارد. بررسی بیان ژن های باکتریایی در مخمر برای مطالعه فعالیت باکتری در سلول مخمر و نیز تشخیص دلیل بروز رابطه همزیستی بین دو ارگانیسم حائز اهمیت است. واژه های کلیدی: همزیستی، H. pylori، PCR آشیانه ای، P. mirabilis، مخمر گوارشی، ریزدست ورزی، RT-PCR .
- Abstract
- Introduction: Yeasts & bacteria are co-habitants in many environments from food to human body. This co-existence may result in occurrence of biological interactions mostly endosymbiotic relationships between two organisms. In this study the yeast cell manipulation possibility was assessed for the study of yeast cell endosymbionts. The probability of symbiotic relationship existence between the gastrointestinal habitant yeast (Candida spp.) & gastrointestinal bacteria was also analyzed. Methods: For preparing yeast cell for manipulation studies, the yeast cell size was increased by recruiting chemical methods including hyphae induction by the use of N-acetyl glucoseamine & stepwise increase in ethanol concentration of the medium. Changing in yeast cell size was measured by Atomic Force Microscopy (AFM). DNA content of 68 intestinal & 40 gastric yeasts all of wich from the Candida genus were extracted. Nested PCR was performed on yeast samples by recruitment of Proteus mirabilis & Helicobacter pylori urease gene specific primers. P. mirabilis & H. pylori total DNAs & Staphylococcus aureus DNA were used as the positive & negative controls, respectively.The expression of H. pylori urease gene in the yeast Candida spp. was assessed at transcriptional level. Results: Measurement of yeast cell size by AFM after chemical treatments, showed that despite increasing in yeast cell size, the size was not appropriate for the use by micromanipulation tool. 57% of intestinal yeast samples contained H.pylori specific urease gene.While none of the DNA content of the fecal yeasts was amplified by P. mirabilis urease gene specific primers. The negative control DNA was not amplified in the same condition. The PCR products sequencing results showed about 97% hemology between the amplified gene from yeast & H.pylori ureAB gene. The results of H. pylori urease gene expression analysis in the yeast C.spp, showed amplification of a fragment in RT-PCR homologous in size with that of positive sample. This data needs complementary analysis. Discussion: The results demonstrate that despite the probability of endosymbiotic interaction occurrence between H. pylori & intestinal yeast, there is no association between P. mirabilis & fecal yeast as gastrointestinal tract common habitants. It seems that environmental conditions & also yeasts & bacteria requirements play role in symbiotic relationship occurrence. Existence of such relationships may be important in the evolution & pathogenicity of these two organisms. H.pylori urease activity is critical for bacterial intracellular survival. Confirmation of the role of urease in symbiotic relationships between yeast & bacteria needs further studies. Assessment of the bacterial gene expression in the yeast, is important in yeast cell endosymbionts studies & also in finding the reason of symbiotic relationship appearance between two organisms. Key words: symbiosis, H. pylori, nested PCR, P. mirabilis, gastrointestinal yeast, micromanipulation, RT-PCR.
