عنوان پایان‌نامه
اثرملاتونین در رقیق کننده منی برای انجماد پذیری اسپرم قوچ
- رشته تحصیلی
- مهندسی کشاورزی- علوم دامی - فیزیولوژی دام
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی شماره ثبت: 4479;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 49494
- تاریخ دفاع
- ۲۷ شهریور ۱۳۹۰
- استاد راهنما
- حمید کهرام
- دانشجو
- ایرج اشرفی
- چکیده
- فرآیند انجماد اسپرم شامل در معرض قرار گرفتن ابتدایی اسپرم با مواد محافظ انجمادی، کاهش دما به زیر صفر درجه سانتی گراد، ذخیره، ذوب و سرانجام بازگشت به حالت طبیعی است. این تغییرات باعث بروز آسیب های ساختاری و بیوشیمیایی در اسپرم می شود که می تواند زنده مانی و باروری اسپرم را تحت تاثیر قرار دهد. آسیب به غشای اسپرم قوچ بیشتر در محدوده دمایی 10- تا 25- درجه سانتی گراد که به عنوان منطقه تشکیل کریستال یخ شناخته می شود، اتفاق می افتد. لذا استفاده از روشی که بتوان با سرعت بالاتری از منطقه تشکیل کریستالهای یخ عبور کرد باعث بهبود کیفیت اسپرم بعد از انجماد-ذوب می شود. همچنین فرایند محافظت از انجماد موجب افزایش تولید گونه های اکسیژن فعال (ROS) و ایجاد شرایط استرس اکسیداتیو می شود.لذا اهداف این تحقیق عبارت اند از، مقایسه اثر نرخ انجماد کنترل شده و کنترل نشده در فرایند انجماد اسپرم (آزمایش2) و همچنین بررسی اثر آنتی اکسیدانی سطوح مختلف هورمون ملاتونین (0.1، 1، 2، 3 و 4 میلی مولار) در رقیق کننده اسپرم (آزمایش 1 و 4) .نمونه های منی در طول فصل تولیدمثلی به صورت هفته ای 2 بار از 3 قوچ نژاد شال جمع آوری و پس از رقیق سازی به 2 گروه تقسیم شده و هر گروه توسط یک روش انجماد (کنترل شده و کنترل نشده) منجمد و پس از یخ گشایی از نظر ویژگی های جنبایی و نرخ بازیافت مورد بررسی قرار گرفتند. با اتمام فصل تولید مثلی، کیفیت اسپرم های قوچ نژاد شال به شدت کاهش یافت، بدین منظور برای بررسی وضعیت اسپرم نژادهای مختلف قوچ ایرانی در خارج از فصل تولید مثل (آزمایش3) قوچ های نژاد شال، بلوچی، زندی، ماکویی، قزل و دورگ در استان های قزوین، البرز، تهران، آذربایجان غربی و آذربایجان شرقی مورد مطالعه قرار گرفتند. به دلیل عدم حصول نتیجه مطلوب از اسپرم قوچ های ایرانی در خارج از فصل تولید مثل، جهت بررسی اثر آنتی اکسیدانی ملاتونین در فرایند انجماد اسپرم، از اسپرم های 4 راس گاو هلشتاین استفاده شد. بعد از جمع آوری و مخلوط شدن نمونه های منی، با رقیق کننده سیترات –زرده تخم مرغ رقیق شده و سطوح مختلف ملاتونین به رقیق کننده اضافه شد. بعد از طی مراحل سرد سازی و تعادل، فرایند انجماد-یخ گشایی صورت گرفته و ویژگی های کنتیکی جنبایی، زنده مانی، یکپارچگی غشای پلاسمایی، در صد اسپرم ها با مرفولوژی غیر طبیعی، درصد اسپرم ها با آکروزوم غیرطبیعی، پتانسیل آنتی اکسیدانی تام و همچنین میزان پراکسیداسیون لیپید مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل از آزمایش 1 نشان می دهد رقیق کننده اسپرم قوچ حاوی 1میلی?مولار ملاتونین در مقایسه با گروه شاهد،موجب بیشترین درصد جنبایی پیشرونده،سرعت در مسیر میانگین،سرعت در مسیر مستقیم و درصد خطی بودن جنبایی بعد از 48 ساعت نگهداری در دمای ?C5 می?شود. اثر دوروش انجماد (نرخ انجماد کنترل شده و کنترل نشده) بر ویژگی?های جنبایی اسپرم قوچ نژاد شال بعد از فرایند انجماد-یخ?گشایی بیان می کند که نرخ انجماد کنترل شده (روش 1) نسبت به روش کنترل نشده (روش 2) موجب بهبود معنی?داری (05/0P<)در جنبایی کل و پیشرونده قبل و بعد از انجماد و نرخ بازیابی جنبایی شده و همچنین موجب افزایش معنی?دار (05/0P<) سرعت در مسیر مستقیم و سرعت در مسیر منحنی در اسپرم های منجمد-یخ گشایی شده می شود. نتایج حاصل از آزمایش3 نشان داد که اسپرم قوچ های ایرانی در خارج از فصل تولید مثل برای فراوری مناسب نبوده و توانایی انجماد خود را از دست می دهند. همچنین بر اساس یافته های حاصل از آزمایش 4 ،غلظت 2 میلی?مولار ملاتونین بیشترین افزایش (05/0P<)را در راستی مسیر طی شده و خطی بودن جنبایی را نسبت به سایر سطوح تیماری در اسپرم منجمد-یخ گشایی شده گاو داشته است که این غلظت همراه با غلظت 1 میلی?مولار بیشترین افزایش (05/0P<)را نیز در درصد جنبایی کل، جنبایی پیشرونده و کاهش اسپرم با موفولوژی غیرطبیعی داشته و همراه با غلظت 3 میلی?مولار موجب بیشترین افزایش در جنبایی عرضی سر، زنده?مانی و یکپارچگی غشای پلاسمایی شده است.سطوح 1 و 2 میلی مولار ملاتونین بیشترین افزایش را در ظرفیت آنتی اکسیدانی تام داشته و غلظت های 1، 2 و 3 میلی مولار ملاتونین موجب کاهش معنی دار(05/0P< ) تولید مالون دی آلدهاید نسبت به گروه شاهد شده که سطح 2 میلی مولار ملاتونین بیشترین کاهش را در پراکسیداسیون لیپید موجب شده است.
- Abstract
- spermatozoa are sensitive to extreme changes in temperature during the freeze-thaw process, also Oxidative damage to sperm resulting from reactive oxygen species generated by the cellular components of semen during liquid and frozen storage is possibly one of the main causes of the decline in quality of sperm during storage, so the aim of this study were to determine the effects of two cooling method (controlled-rate and uncontrolled-rate) on pre-freezing and post-thaw sperm motility parameters (experiment 2), also we investigated the effects of melatonin as an antioxidant on sperm motility parameters in liquid storage of chall rams semen at ?°C (experiment 1) and on microscopic–oxidative stress parameters of bull semen following cryopreservation (experiment 4). We examined the effects of seasonal variations of semen freezability in several breeds of ram, since we observed low quality of ram semen in the end of breeding season. Ejaculates were collected using the artificial vagina and diluted with a Trisbased or citrate-base extender. In exprement 1and4, the extender included of different dose of melatonin (0, 0.1, 1, 2, 3 and 4 Mm). Extended semen packed in straws. Then, the samples were processed according to the cooling and freezing methods and plunged into liquid nitrogen. In experiment 1, the extender supplemented with 1 mM melatonin led to higher percentages of progressive motility and LIN and higher value of VSL and VAP in comparison to the control (P < 0.05) following the cooling process. The treatment of semen samples with melatonin at all doses did not cause a significant (P > 0.05) effect in ALH and STR of the whole semen compared to the control sample. The result of experiment 2 show that, the controlled rate of freezing (method 1) significantly improved the pre-freezing and post-thaw total and progressive motility compared with the uncontrolled rate (method 2). In specific kinetic parameters, method 1 gave significantly higher value for VSL and VCL in comparison with method 2. There were no significant differences between the two methods for VAP and LIN. In experiment 3, we observed season exerts a significant influence on semen freezability in rams, with the best performance occurring the autumn period, corresponding to the reproductive season in temperate zones. The use of bull semen extender supplemented with 2 mM melatonin led to the highest value (P < 0.05) for post-thaw total motility, progressive motility, STR, LIN, ALH, live sperm, hypoosmotic swelling test (HOST) and TAC compared to the control group. No significant differences were observed in acrosome damage, VCL, VAP and BCF following the thawing process, the levels of malondialdehyde (MDA) decreased (P < 0.05) with the addition 2 mM , compared to the control. In conclusion, supplementation of melatonin to the semen extender can improve the semen quality and the controlled rate of cooling conferred bettercryopreserving ability to ram spermatozoa compared with the uncontrolled rate of cooling prior to programmable freezing. Key words: Ram semen, bull semen, controlled cooling rate, melatonin, seasonal variations, and semen cryopreservation
