عنوان پایان‌نامه
مطالعه تغیرات کشش سطحی در حین تبدیل انسولین به فیبریل های آمیلوئیدی و ارتباط آن با اثر سمیت فیبریل ها
- رشته تحصیلی
- بیوفیزیک
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک شماره ثبت: 10966ب;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 50472
- تاریخ دفاع
- ۲۹ شهریور ۱۳۹۰
- دانشجو
- احسان کچویی
- استاد راهنما
- علی اکبر موسوی موحدی
- چکیده
- بیش از 20 پروتئین و پپتید، با توالی و ساختار فضایی کاملا متفاوت، موجب بیماری های آمیلوئیدی می شوند. بین شکل فضایی و سه بعدی آمیلوئید و اثرات سمی سلولی آن ارتباط ویژه ای وجود دارد. انسولین تحت شرایط مشخصی از محلول که باز شدن نسبی مولکول ها را موجب شود، از قبیل شرایط اسیدی، دمای بالا و هم زدن محلول، می تواند ساختار های بسیار منظم فیبریل آمیلوئیدی با محتوی زیادی از صفحات بتا را تشکیل دهد. در این مطالعه، سینتیک تشکیل فیبریل های آمیلوئیدی با استفاده از تکنیک های فلورسانش ThT، جذب نوری قرمز کنگو، دو رنگ نمایی دورانی دور و میکروسکوپ نیروی اتمی دنبال شد. مطالعات دو رنگ نمایی دورانی نشان می دهد که فیبریل های آمیلوئیدی عمدتا از صفحات بتا تشکیل شده اند، در حالی که الیگومر ها دارای ساختار دوم آلفا می باشند. اثرات سمی سلولی فیبریل های آمیلوئیدی با زنجیره های جانبی آبگریز و اندرکنش آنها با غشا و ترکیبات سلولی، در ارتباط می باشد. همچنین تغییرات کشش سطحی محلول با تغییرات آبگریزی ساختار انسولین در ارتباط است و با تکنیک های ویلهلمی و حلقه¬ی دو نوی مورد سنجش واقع شد. با استفاده از این تکنیک ها، علاوه بر کشش سطحی، برخی از ویژگی های فیزیکوشیمیایی انسولین از جمله غلظت بحرانی تجمع (CAC)، پروتئین اضافی در سطح و همچنین انرژی آزاد بررسی شد. با توجه به نتایج بدست آمده، تشکیل فیبریل های آمیلوئیدی موجب افزایش کشش سطحی می شود که به معنی کاهش مناطق آبگریز و همچنین کاهش انرژی آزاد و پروتئین اضافی سطحی می باشد. در مسیر تشکیل فیبریل های آمیلوئیدی، چندین حدواسط از جمله الیگومر و پروتوفیبریل ها وجود دارند. اندازه گیری کشش سطحی برای این حدواسط ها نشان می دهد که با تشکیل الیگومر ها و پروتوفیبریل ها، مقدار مناطق آبگریز در مقایسه با فیبریل های بالغ افزایش می یابد و می تواند به معنی اثرات سمی بیشتر این حدواسط ها در مقایسه با فیبریل های بالغ باشد. در غلظت پایین از ساختار های آمیلوئیدی، بقای سلول های PC12 که در معرض ساختارهای الیگومر، پروتوفیبریل و فیبریل قرار گرفته اند، دستخوش تغییر چندانی نمی شود ولی در همان غلظت، ریخت شناسی سلول های PC12 تمایز یافته تحت تاثیر قرار می گیرد. به منظور بررسی رشد و ارتباطات سلول های تمایز یافته و اثر حدواسط های فیبریلی، معیار هایی از قبیل اندازه جسم سلولی، متوسط طول نوریت، متوسط عرض نوریت، تعداد نوریت های اولیه، در¬صد سلول های دوقطبی و نسبت گره به نوریت اولیه را مورد مطالعه قرار دادیم. نتایج حاصل نشان می دهد که الیگومر ها رشد و ارتباط شبکه سلول ها را، با شدت بیشتری نسبت ساختارهای دیگر، مختل می کند. بنابراین، می توان نتیجه گرفت که کاهش کشش سطحی، افزایش مناطق آبگریز و سطح در دسترس انسولین را به دنبال می کند و چنین شرایطی برای رشد و حتی حیات سلول ها زیانبار می باشد.
- Abstract
- Some polypeptides and proteins with unrelated sequences and tertiary structures have been shown to be involved in amyloidoses. There is a linkage between three dimensional conformation of amyloid protein and cell cytotoxicity. Aggregation of insulin molecules into highly structured amyloid fibrils with an extensive content of beta-sheet is induced under solution conditions that promote partially unfolding, such as low pH, temperature and agitation. In present study, kinetic of amyloid fibril formation is followed by ThT fluorescence, circular dichroism, Congo red and atomic force microscope (AFM). Circular dichroism studies show that fibril structures of insulin have prominently beta structure, while dominant oligomeric structures composed of alpha helix. Toxicity of amyloid fibrils for cells is associated with hydrophobic side chains that expose to solvent and their interactions with cellular compounds or cell membrane. Surface tension changes of solution are attributed to hydrophobicity changes of insulin structure and are detected by Du Noüy Ring and Wilhelmy method. Using these methods, and besides surface tension, we are able to follow some physicochemical properties of protein including critical aggregation concentration (CAC), protein excess at the interface and also changes of free energy. According to acquired results, formation of amyloid firbrils increase surface tension of solution that might be interpreted to decrease of hydrophobicity as well as reduction of free energy and the excess protein at the interface. There are some intermediates such as oligomers and protofibrils during formation of fibrils. Surface tension of these intermediates is detected and corresponding results show that hydrophobicity of solution is enhanced by forming of oligomeric and protofibrillar structure in comparison with fibrillar one that indicates oligomers and protofibrils may be more toxic than mature fibrils for cells. Cell viability study does not show any significa
