عنوان پایان‌نامه
جداسازی و شناسایی عامل ویروس
- رشته تحصیلی
- بهداشت و بیماریهای آبزیان
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه دانشکده دامپزشکی شماره ثبت: 403 ت;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 46552;کتابخانه دانشکده دامپزشکی - مخزن مرد آباد شماره ثبت: 403 ت
- تاریخ دفاع
- ۰۹ تیر ۱۳۸۹
- دانشجو
- محدث قاسمی
- چکیده
- این مطالعه به منظور جداسازی و شناسایی عامل ویروسی بیماری نکروز عصبی ویروسی(Viral nervous necrosis ) از ماهیان کفال طلایی دریای خزر صید شده در صیدگاههای استانهای گیلان و مازندران انجام شده است. برای این منظور در طول فصول صیدطی سالهای 1385 تا 1388 تعداد 312 ماهی کفال طلایی با علایم شنای نامتعادل، تیرگی رنگ و اتساع محوطه شکمی در محدوده وزنی 50 تا 250 گرم جمع آوری گردید. ماهیان مذکور در کالبد گشایی هیچگونه علامتی بجز بادکردگی واضح کیسه شنا نداشتند. ابتدا بافتهای مغز و چشم در شرایط استریل جداسازی شده و جهت انجام آزمایشات کشت سلولی و Nested-RT-PCR در فریزر C ° 80 – نگهداری شدند. به طور همزمان قطعاتی از بافتهای مذکور در فرمالین 10 درصد جهت انجام آزمایشات بافت شناسی و ایمونوهیستوشیمی و قطعه ای در گلوتارآلدهید 3 درصد برای آزمایش میکروسکوپ الکترونی تثبیت گردیدند. آثار آسیب سلولی ( CPE ) 6 روز بعد از تلقیح هموژن فیلتر شده بافتهای مغز و چشم بر روی تک لایه سلولی SSN-1 به صورت واکوئولاسیون مشاهده شد که در پاساژهای دوم و سوم نیز با شدت بیشتری ایجاد گردید. در مجموع تلقیح هموژن 9 نمونه از 312 ماهی باعث ایجاد CPE گردید. تیتر نوداویروس جدا شده در این تحقیق TCID50 7/4 10 ×1 تعیین شد. انجام آزمایش Nested- RT-PCR بر روی نمونه های بافتی و سلول های SSN-1 دارای CPE نتایج مشابهی را به همراه داشت. در آزمایش مستقیم بافت آلوده تعداد 21 نمونه مثبت بوده وهمچنین تمام نمونه های حاصل از سلولهای SSN-1 حاوی CPE در آزمایش مثبت تشخیص داده شدند. به منظور تایید تشخیص نوع ویروس، آزمایش آنتی بادی درخشان غیرمستقیم با استفاده از 2 نوع آنتی بادی مونوکلونال مختلف برروی مقاطع بافتی مغز و چشم ماهیان کفال دارای علایم وکشت های سلولی SSN-1 حاوی CPE انجام شد که ایجاد نقاط درخشان حاکی از وجود آنتی ژن نودا ویروس در نمونه های مورد آزمایش بود. در بررسی آثار بافتی بر روی نمونه های فرمالینه، واکوئولاسیون در مقاطع مغز و شبکیه چشم، نخاع و عصب بینایی در اکثر نمونه ها مشاهده گردید. در ادامه با استفاده از آنتی بادی مونوکلونال ضد نودا ویروس و رنگ آمیزی DAB بر روی مقاطع بافتی در آزمایش ایمونوهیستوشیمی حضور آنتی ژن های نودا ویروس به صورت نقاط قرمز- قهوه ای مشخص گردید. در آزمایش میکروسکوپ الکترونی با توجه به پراکندگی ویروس در نمونه های بافتی، مقاطع ویروس به صورت دوایری با قطر حدود nm 30 و دارای آرایش منظم تنها در یک مقطع چشم ماهی کفال مشاهده گردید. نتایج حاصله نشان داد که حضور نودا ویروس با بروز علایم بالینی و کالبد گشایی و تلفات در ارتباط بوده و می توان نودا ویروس را به عنوان عامل اصلی تلفات کفال ماهیان طلایی دریای خزر محسوب نمود.
- Abstract
- The present study describes the isolation and characterization of viral nervous necrosis disease (VNN) in golden gray mullet (Liza auratus) in Iranian costal area of the Caspian Sea, Guilan and Mazandaran areas. Clinicaly the moribund fish were abnormal in swimming behaviour showing whirling, belly up at rest, darkening and abdominal distention. A number of 312 moribund fish weighing 80 to 250 grams were obtained during 2006-2008. Samples of brain and eye tissues were collected and stored at -80°C for cell cultivation and Nested-RT-PCR purposes. Also same samples of brains and eyes were fixed in 10 percent formalin buffer for histopathology and immunohistochemistry examinations. Parts of the samples were transferd in %2.5 glutaraldhide for electron microscopy study. Viral isolation on SSN-1 cell line at 25°C resulted in the appearance of cytopathic effect( CPE ) 6 days post-inoculation of filterated homogenates of brain and eye. The CPE was seen also in the second and third sub-cultivation passages. A total of 9 samples were positive for CPE induction and virus isolation. Nested-RT-PCR resulted in 21 positive samples for tissue samples of brain and eye and 9 samples of positive CPE. Using of two different monoclonal antinodavirus were used in immunoflorecent antibody test on tissue sections of brain and eye of moribund fish plus affected SSN-1 cells resulted in positive reactions showing golden bright color under florescent microscopy. Histopathological study also showed extensive vacoulation in section of brain, retina, spinal cord and nervous opticus. Furthermore immunohistochemistry examination carried out using monoclonal antinodavirus and DAB staining resulted in the appearance of golden brown in color under light microscopy. In electron microscopy, a virus – like particle with 30 nm in diameter and a regular arrangement were also observable. Therefore, presence of the betanodavirus in tissues of moribund golden grey mullet can be considered with the mullet mortality in the Caspian Sea.
