عنوان پایان‌نامه
مطالعه مولکولی ژن پلیمراز
- رشته تحصیلی
- دامپزشکی
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه دانشکده دامپزشکی شماره ثبت: 431 ت;کتابخانه دانشکده دامپزشکی - مخزن مرد آباد شماره ثبت: 431 ت;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 48648
- تاریخ دفاع
- ۳۰ دی ۱۳۸۹
- استاد راهنما
- محمدحسن بزرگمهری فرد, وحید کریمی
- دانشجو
- جعفر پازانی
- چکیده
- پروتئین PB2 ویروس های آنفلوانزای A و وجود برخی اسید آمینه های خاص در جایگاه های خاص آن، نظیر پروتیین HA، نقش مهمی در تعیین طیف میزبانی آنها دارد. در این مطالعه بخشی از ژن PB2 از 13 جدایه ویروس آنفلوانزای تحت تیپ H9N2 جدا شده از جوجه مرغ های تجاری در استان تهران طی سال های 1377 تا 1387 تکثیر شدند و توالی اسید نوکلئوتیدی و اسید آمینه ای آنها تعیین گردید. تجزیه و تحلیل توالی های بدست آمده و مطالعه شجره شناسی به روی این توالی ها و مقایسه آنها با برخی توالی های موجود در بانک جهانی ژن از ژن PB2 ویروس های H9N2 انجام گردید. علاوه بر مطالعه شجره شناسی، بیماری زایی این جدایه ها و امکان انتقال جانبی آنها در میزبان پستاندار در مدل موش BALB/c مورد مطالعه قرار گرفت. مطالعه شجره شناسی بر روی توالی های نوکلئوتیدی ژن PB2 استفاده شده در این مطالعه نشان داد که ایزوله های H9N2 استان تهران را می توان در دودمان اروپایی- آسیایی طبقه بندی نمود؛ همانطوریکه براساس نتایج بدست آمده از مطالعه های انجام شده به روی ژن HA نیز مشخص شده است. منشاء ژن PB2 جدایه های H9N2 ایران نظیر اکثر جدایه های خاور میانه نامشخص است ولی می توان دو گروه مجزا شامل جدایه های سال های 1998 تا 2004 یا گروه یک ایران- استان تهران و جدایه های جدیدتر طی سال های 2005 تا 2008 یا گروه دو ایران استان تهران در میان آنها مشخص کرد. درصد مشابهت نوکلئوتیدی ژن PB2 جدایه های IR-TH1 با جدایه های کشورهای خاور میانه نظیر پاکستان و با جدایه های شبه قاره هند پایین است. درصد مشابهت نوکلوتیدی پایین PB2 جدایه های IR-TH1 با ویروس های G1-Like و نیز با جدایه های 1999 پاکستان در کنار اطلاعات بالا احتمال وجود بازاریی اجداد ویروس های IR-TH1 را با تحت تیپ های دیگر انفلوانزای A مطرح می سازد. در این مطالعه مشابهت ویروس های IR-TH1 با جدایه هایی از چین به 97% میرسد که مربوط به محدوده زمانی یکسان یعنی 1998 تا 2004 میباشد. این موضوع ویروس های H9N2 چین را به عنوان منشا احتمالی ژن PB2 جدایه های IR-TH1 و یا کاندیدی برای بازارایی با آنها مطرح می سازد. مشابهت نوکلوتیدی PB2 ویروس های IR-TH2 با ویروس های سال های جدید کشورهای منطقه و هند بالاست و می توان آنها را جزء دودمان احتمالی جدیدی به نام Indian-subcontinent and Middle-East محسوب کرد. در ژن PB2 جدایه های H9N2 استان تهران insertion and deletion مشاهده نمی گردد. در پروتئینPB2 جدایه های H9N2 استان تهران که در این مطالعه بررسی شده اند در محل اسید امینه 621 گلوتامیک اسید، در محل 701 آسپارتیک اسید و در محل 714 سرین قرار دارد. در مطالعاتی که تا کنون در سطح دنیا انجام شده است وضعیت مشابهی در مورد تحت تیپ های مختلف جدا شده از گونه های پرندگان نشان داده شده است. در مطالعه بیماری زایی جدایه های مورد مطالعه در موش های BALB/c بررسی تیتر ویروس در ریه و نای موش های گروه های آزمایش مختلف تلقیح شده با 50 میکرولیتر مایع کوریوآلانتوئیک حاوی EID50 106 پارتیکل ویروسی در هر 50 میکرولیتر به روش داخل بینی با هر جدایه و گروه کنترل در روزهای سوم و پنجم بعد از تلقیح انجام شد. حضور ویروس در ریه و نای موش های دیده بان بدون تلقیح رها شده در میان موش های تلقیح شده هر گروه آزمایش در روزهای پنجم، نهم و دوازدهم بعد از تلقیح با تست RT-PCRبه روی بافت و مایع آلانتوئیک حاصل از تزریق صلایه بافتی به تخم مرغ جنین دار ده روزه بررسی شد. مطالعه هیستوپاتولوژی و ایمونوهیستوشیمی به روی نمونه های بافتی اخذ شده از ریه، نای و اندام های داخلی موش های تلقیح شده و دیده بان تلقیح نشده در گروه های آزمایش و گروه کنترل در روز های سه، پنج، نه، دوازده، پانزده، بیست ویک و بیست وهشت بعد از تلقیح انجام شد. بررسی میانگین وزن موش های تلقیح شده و تلقیح نشده در هر گروه و در گروه کنترل در روز های سه، پنج، نه، دوازده، پانزده، بیست و یک و بیست و هشت بعد از تلقیح انجام شد. نتایج حاصل نشان میدهد که جدایه های H9N2 استان تهران در این مطالعه از موش های تلقیح شده گروه های آزمایش طی 12 روز تماس به موش های دیده بان منتقل نشده است. نتایج حاصل نشان دادند که جدایه های H9N2 استان تهران در میزبان پستاندار مدل موش BALB/c تلفات ایجاد نمیکند ولی می توانند در طی سه تا پنج روز بعد از تلقیح در ریه آنها تکثیر یابند و در طی پنج تا نه روز بعد از تلقیح در آنها کاهش وزن ایجاد نمایند. نتایج مطالعه هیستوپاتولوژی و ایمونوهیستوشیمی نشان داد جدایه های H9N2 استان تهران در میزبان پستاندار مدل موشBALB/c در طی پنج روز بعد از تلقیح در ریه ضایعه Bronchointerstitial pneumonia و در آسینی های اگزوکرین پانکراس دژنرسانس آبکی و تخلیه دانه های زایموژن ایجاد می نمایند.
- Abstract
- The PB2 protein of influenza A viruses and the presence of especial amino acids at especial positions along with HA protein is an important host range determinant. In this study, PB2 genes of 13 H9N2 isolates isolated from commercial chicken farms of Tehran province of Iran during 1998 to 2008 were partially amplified, sequenced and amino acid sequences of them were assigned. The sequences were analyzed and phylogenetic study was done comparing them to some of deposited sequences of PB2 genes in Gene bank. Moreover, pathogenicity of these isolates and the possible transmission of them between mammalian hosts were studied in BALB/c mouse model. Phylogenetic study on nucleotide sequences of PB2 gene showed that H9N2 isolates of Tehran province can be classified in Eurasian lineage as shown by studies on HA gene, too. The source of PB2 gene of Iranian isolates as most of the isolates from Middle-East is unknown. Anyway according to phylogenetic study on PB2 gene, two different groups can be distinguished among these Iranian H9N2 isolates as Iranian-Tehran province group 1 or IR-TH1 containing isolates from 1998 to 2004 and Iranian-Tehran province group 2 `or IR-TH2 containing isolates from 2005-2007. Identity percentage between nucleotide sequences of IR-TH1 isolates and Middle-East countries like Pakistan and isolates of Indian-subcontinent is low. Low identity percentage between IR-TH1 isolates with G1-like H9N2 viruses and 1999 isolates from Pakistan propose the probability of recombination of ancestors of IR-TH1 isolates with other subtypes of influenza A viruses. It is showed that identity percentage between IR-TH1 isolates and Chinese isolates especially from the same period of 1998 to 2004 is high. This high identity can suggest Chinese isolates as the source of PB2 gene of IR-TH1 isolates or the candidate for recombination with Iranian isolates. There is a high identity percentage between nucleotide sequences of PB2 gene of IR-TH2 isolates and the resent isolates from Middle-East countries and Indian-subcontinent; so, these isolates can be considered as the member of a probable PB2 lineage named Indian-subcontinent and Middle-East. There is found no insertion and deletion in PB2 genes of these H9N2 isolates of Tehran province. In amino acid sequence of PB2 protein of H9N2 isolates of Tehran province there is Glutamic acid at position 627, Aspartic acid at 701 and Serine at position 714. This is the same as seen in different subtypes isolated from different kinds of birds. To study the pathogenicity of the isolates of Tehran province in BALB/c mice, the virus titer were determined in lunges and tracheas of inoculated mice with 50µl coryoalantoic fluid containing 106 EID50/50µl of virus for each mouse in treatment groups and of non-inoculated mice in control group in three and five post inoculation day. Presence of virus in the lungs and tracheas of non-inoculated sentinel mice in each treatment group were tested on five, nine and twelve day post inoculation by PCR done directly on tissue samples and also on harvested alantoic fluid from inoculated eggs by them. Histopathology and immunohistochemistery tests were done on tissue samples taken from lungs, trachea and internal organs of inoculated and non-inoculated sentinel chicks of each treatment group and from non-inoculated mice of control group on days three, five, nine, twelve, fifteen, twenty one and twenty eight days post inoculation. The mean weights of inoculated and non-inoculated sentinel mice of each treatment group and from non-inoculated mice of control group was compared between three, five, nine, twelve, fifteen, twenty one and twenty eight days post inoculation. The results showed that H9N2 isolates from Tehran province were not transmitted from inoculated BALB/c mice to sentinels of all treatment groups during 12 days of contact time. These results also showed that the H9N2 isolates of Tehran province don`t cause mortality in BALB/c mice but can replicate in their lunges in three to five PIDs and induce weight loss in them in five to nine PIDs. The results gotten in histopathology and immunehistochemistry studies showed that H9N2 isolates of Tehran province can cause Bronchointerstitial pneumonia in the lungs and hydropic degeneration and depletion of zymogene granules in the pancreas of inoculated BALB/c mice in five post inoculation days.
