عنوان پایان‌نامه
تشخیص مولکولی استرپتوکوکوسی های گرم و مثبت
- رشته تحصیلی
- بهداشت و بیماریهای آبزیان
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه دانشکده دامپزشکی شماره ثبت: 424 ت;کتابخانه دانشکده دامپزشکی - مخزن مرد آباد شماره ثبت: 424 ت;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 47817
- تاریخ دفاع
- ۲۰ دی ۱۳۸۹
- دانشجو
- سمیه حقیقی کارسیدانی
- استاد راهنما
- مهدی سلطانی
- چکیده
- این مطالعه به منظور بررسی مقایسه ای روشهای تشخیص سنتی و کیت های تشخیص سریع بیوشیمیایی(API) و روشهای مولکولی با تاکید بر تشخیص همزمان 3 عامل اصلی ایجاد کننده بیماری استرپتوکوکوزیس در مزارع پرورش قزل آلای رنگین کمان کشور شامل استرپتوکوکوس اینیایی، استرپتوکوکوس پارااوبریس و لاکتوکوکوس گارویه با استفاده از PCR چند تایی(M-PCR) انجام شد. استرپتوکوکوزیس از مهمترین بیماریهای ماهیان قزل آلا است که بدلیل پرورش متراکم شیوع یافته و موجب خسارات اقتصادی زیادی می گردد. ماهیان بیمار دارای علائم اگزوفتالمی یک طرفی و دوطرفی، تیرگی رنگ، کدورت قرنیه و خونریزی در چشم ، اتساع محوطه شکمی و بیرون زدگی ناحیه مخرج همراه پرخونی و خونریزی می باشند. در این مطالعه 108 جدایه کوکسی گرم مثبت از ماهیان قزل آلای رنگین کمان پرورشی 7 استان مهم تولید کننده قزل آلای رنگین کمان کشور شامل: گیلان، مازندران، تهران، کرمانشاه، چهارمحال و بختیاری، لرستان و فارس جداسازی گردید. نتایج بررسی های فنوتیپی با استفاده از روش سنتی و سیستم های API (API 50CH، API 20STREP و API Rapid 32STREP) نشان داد که 49 نمونه(37/45%) استرپتوکوکوس اینیایی ، 37 نمونه(2/35%) لاکتوکوکوس گارویه و 22 نمونه (43/19%) جنس استرپتوکوکوس بودند. در بررسی های مولکولی با استفاده از پرایمر های یونیورسال مربوط به جنس های استرپتوکوکوس و انتروکوکوس، تمامی 108 جدایه با ایجاد باند 500 جفت باز(bp)، متعلق به جنس استرپتوکوکوس تشخیص داده شدند و در آزمایش PCR ساده با استفاده از پرایمرهای اختصاصی استرپتوکوکوس اینیایی، استرپتوکوکوس پارااوبریس، لاکتوکوکوس گارویه، استرپتوکوکوس آگالاکتیه و استرپتوکوکوس دیس گالاکتیه، 64 جدایه(2/59%) با ایجاد باند 870 جفت باز(bp)، استرپتوکوکوس اینیایی و 44 جدایه(8/40%) با بند 1100 جفت باز لاکتوکوکوس گارویه تشخیص داده شدند. در آزمایش PCR چند تایی، با استفاده همزمان از 3 جفت پرایمر اختصاصی استرپتوکوکوس اینیایی، استرپتوکوکوس پارااوبریس، لاکتوکوکوس گارویه، دو باند مربوط به استرپتوکوکوس اینیایی(870 جفت باز) و لاکتوکوکوس گارویه(1100 جفت باز) به طور همزمان تشخیص داده شد. آزمایش PCR چند تایی با استفاده همزمان از 3 جفت پرایمر اختصاصی مربوط به استرپتوکوکوس اینیایی، استرپتوکوکوس پارااوبریس، لاکتوکوکوس گارویه نتایج PCR ساده را تایید کردند. مقایسه آزمایشات انجام شده نشان داد که آزمایشات مولکولی در شناسایی کامل و سریع گونه های استرپتوکوکسی ها نسبت به روشهای بیوشیمیایی سنتی و کیت API موثرتر بوده و از دقت بالاتری بر خوردارند. بررسی های فیلوژنتیکی استرپتوکوکوس اینیایی جدا شده در ایران بر اساس ژن لاکتات اکسیداز(LctO)، بیشترین شباهت ژنتیکی را به سویه های استرالیا و چین داشته و بر اساس توالی ژن 16SrRNA ، بیشترین شباهت ژنتیکی را به نمونه های تایوان و برزیل داشت و در کلاستر جداگانه ای نسبت به نمونه قبلی گزارش شده از ایران(اخلاقی و همکاران،2009) قرار داشت و لاکتوکوکوس گارویه جداشده درتحقیق بر اساس توالی ژن 16SrRNA بیشترین شباهت را به نمونه چین، ژاپن ، نمونه قبلی گزارش شده از ایران(اخلاقی و همکاران،2008) و شیلی داشتند و تنها یکی از نمونه ها با تفاوت بسیار کمی در کلاستر مجزا قرار گرفت. نتایج نشان داد فاصله ژنتیکی قابل توجهی بین باکتریهای استرپتوکوکوس اینیایی و لاکتوکوکوس گارویه ایران و سایر کشورها وجود نداشته و همه یک منشاء مشترک دارند.
- Abstract
- In this study 108 Gram positive cocci bacterial isolates were obtained from diseased rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in seven states with major trout production in Iran during 2008 till 2009. Results of phenotypic features showed that 49 samples (45.37%) were identified as Streptococcus iniae, 37 samples (35.2%) matched with Lactococcus garvieae; and 22 samples (19.43%) were identified as members of Streptooccus genus by culture-based and biochemical tests of API 50 CH, API 20 STREP and rapid 32 STREP systems. Using universal primers for differentiation of Streptococcus sp. and Enterococcus sp all 108 samples were identified as Streptococcus sp. with a target region of 500 bp. Single specific PCR resulted in identification of 64 (59.2%) isolates as S. iniae and 44 (40.8%) isolates as L. garvieae by showing bands of 870bp and 1100bp respectively. A multiplex PCR assay was used for the simultaneous detection of Streptococcus iniae, Streptococcus parauberis and Lactococcus garviae from pure cultures. the multiplex PCR (m-PCR) assay resulted in the amplification of bands of 870 bp for 64 isolates of S. iniae and 44 isolates of L. garvieae that confirmed the results of single/Uniplex PCR. The phylogenetic analysis of the S. iniae isolates based on 16SrRNA gene resulted in maximum similarity to some strains reported from Taiwan and all Brazilian strains. Also, analysis of S. iniae lctO gene sequence showed that this isolate clustered within the S. iniae group. The sequence analysis of L. garvieae strains also showed that they have maximum similarity to all Japanese and Chinese strains, but one strain has lower sequence similarity values with all other recorded strains. The results of this study clearly show that trout farming in Iran is severely affected by both species of S. iniae and L. garvieae and therefore required serious preventive criteria.
