عنوان پایان‌نامه
تعیین هویت مولکولی ژن غشائی نخستین سویه برونشیت جدا شده درسال ۱۳۸۷ از مرغداریهای صنعتی ایران
- رشته تحصیلی
- دامپزشکی
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه دانشکده دامپزشکی شماره ثبت: 411 ت;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 45764;کتابخانه دانشکده دامپزشکی - مخزن مرد آباد شماره ثبت: 411 ت
- تاریخ دفاع
- ۰۳ مهر ۱۳۸۹
- دانشجو
- محمد محسن رفیعی
- استاد راهنما
- مهدی وصفی مرندی
- چکیده
- ویروس برونشیت عفونی(IBV) می تواند ایجاد بیماری تنفسی، التهاب کلیوی، اختلالات تولید مثلی و کاهش وزن شود. با اینحال هیچکدام از این علایم اختصاصی بیماری نیستند و بدین ترتیب برای تشخیص عفونت در گله های مبتلا به ابزار تشخیصی نیاز است. این تشخیص گاهی مستلزم شناسایی نوع ویروس نیز می باشد تا بتوان با انتخاب برنامه واکسیناسیون بهتر، حفاظت بیشتری در گله ایجاد کرد. به طور کلی عفونت با ویروس برونشیت عفونی را می توان به دو طریق شناسایی کل یا جزیی از ویروس IBV(شناسایی آنتی ژن یا ژنوم ویروس) و شناسایی آنتی بادی اختصاصی علیه IBV تشخیص داد. به علت تغییرات آنتی ژنی و ژنتیکی که مرتبا در ویروس برونشیت عفونی رخ می دهد، این ویروس همواره نقطه هدف برای توسعه و اصلاح تست های تشخیصی و متدهای شناسایی IBV بوده است. امروزه روش های تشخیصی بر مبنای ژنوم ویروس کاربرد وسیعی یافته اند. عمده این تکنیک ها واکنش زنجیره ای پلیمرازی((PCR است که می توان به کمک تعیین سکانس اطلاعات بسیار ارزشمندی را در ارتباط با شناسایی ویروس به دست آورد. یکی دیگر از روش های مولکولی که در تشخیص سریع پاتوژن های بیماری زا در یک نمونه مرضی بسیار موثر و کارامد می باشد روش multiplex RT-PCR می باشد. این روش نسبت به سایر روش های مولکولی نظیر single RT-PCR به جهت اینکه با یکبار نمونه گیری و استخراج ژنوم می تواند جهت تشخیص همزمان به چندین پاتوژن و تعیین عفونت های مخلوط به کار می رود. از مزایای تکنیک های ملکولی استفاده از نمونه مستقیم، حساسیت، سرعت و ویژگی بالای آن است. در این مطالعه با استفاده از پرایمر های MIBVPCR و NIBVPCR یک single RT-PCR جهت شناسایی گروه III کرونا ویروس ها و توسط پرایمرهای XCE3-، MCE1+ و BCE1+ یک multiplex RT-PCR جهت تفریق دو سروتیپ ماساجوست و 793B بهینه سازی گردید و در نهایت جهت بررسی حساسیت این تست ها از 48 نمونه کشت مایع آلانتوئیک حاوی نمونه های اخذ شده از طیور دارای علائم تنفسی سال های 1377-1381 که در بررسی قبلی با استفاده از تست HA و VN حاوی 24 نمونه منفی و 23 نمونه مثبت از نظر حضور ویروس انفلوانزا و 2 نمونه مثبت از نظر برونشیت عفونی استفاده گردید. متعاقب بررسی های انجام شده با دو روش مولکولی فوق الذکر علاوه بر دو نمونه مثبت قبلی 5 نمونه دیگر مثبت تشخیص داده شدند که 3مورد از نمونه های مثبت متعلق به سروتیپ 793B و 4 مورد متعلق به سروتیپ ماساچوست می باشند. در ادامه جهت استخراج ژن M ویروس برونشیت عفونی سویه IR-3654-VM به عنوان اولین سویه متعلق به سروتیپ 793B جدا شده در ایران اقدام به طراحی دو پرایمر با نام های MFIBV و MRIBV جهت استخراج و قطعه ای به طول 642 جفت باز از ژن M ویروس برونشیت عفونی سروتیپ 793B گردید. محصول حاصل از single RT-PCR را پس از کلون کردن جهت تعیین توالی ارسال و توالی بدست آمده پس از انجام اصلاحات با شماره دسترسی GU952251 به عنوان سومین توالی ژن M ویروس برونشیت عفونی سروتیپ 793B در بانک جهانی ژن ثبت گردید. متعاقب بررسی های بیو انفورماتیک بروی سکانس اسیدنوکلئیک و اسیدامینه ای ژن M ویروس برونشیت عفونی سویه IR-3654-VM به ترتیب شباهتی معادل 5/95 درصد با دو سویه 4/91-UK با شماره دسترسی GQ227602 و 793B-CHبا شماره دسترسی EU714034 و 3/96 درصد با سویهGray جداشده از ایلات متحده امریکا باشماره دسترسی AF286180 و سویه JMK با شماره دسترسی AF363608 موجود در بانک جهانی ژن نشان دادند. شاید این شباهت قابل تعمیم به ساختار دوم و سوم و فرایندهای بیولوژیک و ایمنوژنیک نباشد. در هر صورت انجام مطالعات تکمیلی برای تعیین خاستگاه این سویه به عنوان پروتوتیپ سروتیپ 793B ایران ضروری است.
- Abstract
- Infectious Bronchitis Virus (IBV) can cause respiratory disease, kidney inflammation, genital disorder and weight loss. So for infection identification in involved flock diagnostic methods should be available. Sometimes for having the best vaccination program and the best protection in the flock the virus species should be identified. Identification of Infectious bronchitis virus could have been done by two methods, which one of them are based on antigen and the other is based on antibody. Because of genetic changes which occur in IBV, development of diagnostic tests is necessary. PCR is one of the most useful techniques which can help for getting diagnostic results and many information with genome sequencing. Multiplex RT-PCR is one of the other molecular methods which is useful in identification of different pathogens and mixed infections in direct samples which is a rapid-high sensitive and specific method. In this study a single RT-PCR with MIBVPCR and NIBVPCR primers for identification of group III of coronaviruses and a multiplex RT-PCR with XCE3- MCE1 and BCE1 primers were optimized for differentiation of 2 serotypes Mass and 793B. finally sensitivity of this test was evaluated by 49 cultured samples in allantoic fluid which were collected from poultry with respiratory signs in 1998-2002 period, they were surveyed before with HA and VN tests and the result were negative for 24 of samples and positive for 23 of samples for existence of influenza virus and 2 samples were positive for IBV. So after the molecular surveillance which explained above the 5 other positive samples were added which three of them were 793B and fourth of them were Mass serotypes. Extraction of M gene of IBV serotype IR-3654-VM which named the first serotype of 793B isolated in Iran were done by one pair primers with name MFIBV, MRIBV were designed for extraction of a strand with 642 bp of IBV M serotype 793B. Single RT-PCR product was cloned, sequenced, edited and submitted in gene bank with GU952251 accession number which is the third sequence of IBV M gene of serotype 793B exist in gene bank. after bioinformatics surveillance of nucleic and amino acid sequence of M gene IBV serotype IR-3654-VM there showed homology about 95.5% with serotypes 4/91/uk (accession number: GQ227602) and 793B-CH (accession number: EU714034) and 96.3% homology with gray serotype isolated from united states of America (accession number: AF286180) and JMK serotype (accession number: AF363608). This similarity is not generalized to second and third structure and biologic and immunogenesis of viruses. Complementary studies for identification of the main source of this prototype are needed.
