عنوان پایان‌نامه
طراحی و ساخت سلول رده شاخص لوسیفراز
- رشته تحصیلی
- ویروس شناسی
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه دانشکده دامپزشکی شماره ثبت: 641 ت;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 81595;کتابخانه دانشکده دامپزشکی - مخزن مرد آباد شماره ثبت: 641 ت;کتابخانه دانشکده دامپزشکی شماره ثبت: 641 ت;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 81595;کتابخانه
- تاریخ دفاع
- ۲۸ بهمن ۱۳۹۴
- دانشجو
- فاطمه قاسمی
- استاد راهنما
- امید مددگار
- چکیده
- مقدمه و ضرورت انجام مطالعه: ویروس عامل بیماری اسهال ویروسی گاو انتشار جهانی دارد و سندروم های بالینی مختلفی را در گاو ایجاد می کند که با خسارات اقتصادی فراوان همراه است. در گزارشات مختلف شیوع بیماری در گله های مختلف و مناطق متفاوت ایران بین 20% تا 90% گزارش شده است. بدلیل نیاز مبرم به شروع برنامه های کلان برای کنترل و پیشگیری از این بیماری در کشور و مشکلات عدیده ای که جامعه دامپزشکان کشور در برخورد با این بیماری در گله های گاو داشته اند، این ویروس برای تحقیق حاضر مورد هدف ما قرار گرفت. هدف مطالعه: هدف از انجام این پایان نامه ساخت مینی ژنوم ویروس عامل اسهال ویروسی گاو و استفاده از آن برای تشخیص این ویروس در کشت سلول، غربالگری داروهای ضد ویروسی و پایه گذاری برای ساخت کلون کامل ویروس است. مینی ژنوم، سازه ای شبیه ژنوم ویروس است که در آن یک ژن گزارشگر توسط توالی های انتهایی ویروس (5'UTR و 3'UTR) که دارای سیگنال هایی برای تکثیر و رونویسی ویروس است، احاطه شده است. چنانچه پلیمراز ویروس بتواند توالی های تنظیمی موجود در مینی ژنوم را در سلول شناسایی کند، تکثیر مینی ژنوم و بیان ژن گزارشگر انجام شده و حضور ویروس در سلول بدین صورت تشخیص داده می شود. مواد و روش کار: در این مطالعه برای نخستین بار در دنیا، دو سازه مینی ژنوم ویروس عامل بیماری اسهال ویروسی گاو بر اساس پروموتر های یوکاریوتی(SV40) و پروکاریوتی (T7) ساخته شد. به طوریکه مینی ژنوم SV40 در جهت سنس در پایین دست پروموتر یوکاروتی SV40 و مینی ژنوم T7 در خلاف جهت سنس در پایین دست پروموتر پروکاریوتی T7 قرار گرفته و فعال کردن و تکثیر این مینی ژنوم توسط پلیمراز ویروس در دو نوع سلول MDBK و T7-BHKبررسی شد. یافته ها: نتایج ما نشان داد که ویروسBVD قادر به شناسایی رونوشت ساخته شده از پروموتر SV40، به عنوان الگوی تکثیر، نمی باشد. در مقابل رونوشت پروموتر T7 به علت شباهت بسیار زیاد به ژنوم ویروس BVD، توسط ویروس، به عنوان الگو، تلقی شده و تکثیر آن توسط پلیمراز ویروس(تهیه شده توسط کلون حاوی ژنوم کامل سویه CP7 ویروس BVD)، موجب بیان ژن گزارشگر می شود. نتیجه گیری: بیان ژن گزارشگر توسط کلون عفونی CP7 نویدی برای استفاده از سازه مینی ژنوم ساخته شده به منظور تشخیص تکثیر ویروس فعال BVD در کشت سلول است. هر چند آزمون مینی ژنوم T7، تنها در سلول T7-BHK با موفقیت انجام شد. سلول MDBK، به علت قابلیت پائین ترانسفکشن نمیتواند انجام این آزمون را پشتیبانی کند. در ادامه این مطالعه، راهکارهایی جهت ادامه این پروژه و تهیه رده گزارشگر ویروس BVD ارائه شده است.
- Abstract
- Introduction:Bovine viral diarrhea (BVD) is one of the most important diseases of cattle responsible for major economic losses in dairy industries of Iran. There are many different studies that have reported the prevalence of 20%- 90% BVDV in Iran`s cattle flocks. So far, no nationwide program has been taken in Iran to control and eradicate the disease. Moreover, until now, no vaccination program has been practiced against BVD in Iran, although the disease is prevailing in the country. Accordingly, BVDV was nominated in this study to discover new approachs that can help improve it`s control, detection and eradication. Objective: The aim of this study is construction of BVDV minigenome for invitro detection of virus in cell culture, antiviral drugs screening and foundation of steps to construct BVDV full genome infectious clone. Minigenome is a system comprising a reporter gene bounded by viral sequences which provide the signals for viral transcription and replication. These can be replicated and transcribed in vitro by the viral replicative genes supplied from replication of wild virus into minigenome containing cells. Material and Methods: In this study, for the first time in the world, two minigenome system was designed based on SV40 and T7 promoters. SV40 and T7 minigenomes were constructed in sense and antisence orientation, respectively and located downstream of the mentioned promoters. Furthermore, we followed the activation and replication of minigenomes in two different cell lines (MDBK and T7-BHK). Results: our results demonstrated that BVDV is unable in recognition of SV40 transcripts as a replicative intermediate. However the transcript of T7 promoter can be recognised by the virus. We showed that BVDV-T7 minigenome can be replicated by transfection of BVDV CP7 infectious clone into minigenome containing cell. Conclusion: although T7 minignome experiment was just successful in T7-BHK cell line ( not MDBK), expression of reporter gene via CP7 infectious clone is a promising sign to use of BVDV minigenome for detection of active replication of BVDV in cell culture. Moreover, some solutions has been presented to construct of BVDV reporter cell line in future studies.
