عنوان پایان‌نامه
ایجاد سویه جهش یافته بروسلا آبورتوس S۱۹ با حذف ژن wbkA و بررسی ایمنی زایی ناشی از سویه جهش یافته
- رشته تحصیلی
- باکتری شناسی
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 75491;کتابخانه دانشکده دامپزشکی شماره ثبت: 625 ت;کتابخانه دانشکده دامپزشکی - مخزن مرد آباد شماره ثبت: 625 ت;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 75491;کتابخانه دانشکده دامپزشکی شماره ثبت: 625 ت;کتابخانه
- تاریخ دفاع
- ۲۰ آبان ۱۳۹۴
- دانشجو
- سولماز ناصرلی
- استاد راهنما
- تقی زهرائی صالحی, بهار نیری فسایی
- چکیده
- بروسلوز در گاو یک بیماری زئونوز با شیوع جهانی می¬باشد که با سقط جنین و کاهش قدرت باروری خود را نشان می دهد. عامل بیماری که باکتری بروسلا آبورتوس می باشد، توانایی رشد و تکثیر در سلول های سیستم رتیکلواندوتلیال را دارد و با جایگزین شدن داخل سلول ها در تمام بدن میزبان گسترش می یابد. از میان واکسن های موجود علیه این بیماری، واکسن تهیه شده از سویه 19 بروسلا آبورتوس (19S) واکسن انتخابی ایمن سازی علیه بروسلوز گاوی بوده و با بالاترین میزان مصرف در سطح جهان، در مبارزه علیه بیماری موثر بوده است که امروزه به دلیل بروز مشکلات تفریقی در زمان استفاده از این واکسن، از سویه وحشی مصرف آن با محدودیت هایی مواجه شده است. هدف از این مطالعه، انجام حذف ژنی در باکتری بروسلا آبورتوس 19S به منظور رفع نقیصه این سویه در تست-های تشخیصی، با حداقل میزان تغییرات در تحریک سیستم ایمنی است. بدین منظور تلاش گردید تا ژن کد کننده آنزیم مانوزیل ترانسفراز (wbk A)، یکی از ژن های درگیر در سنتز زنجیره O ساختار LPS دیواره باکتری، از طریق انجام نوترکیبی حذف گردد. همچنین در این تحقیق از روش Overlap Extension PCR به عنوان یک تکنیک اصلاح شده جهت حذف و جایگزینی ژن هدف استفاده شد. بدین ترتیب که، با انجام دو مرحله PCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، قطعات بالادست و پایین دست ژن هدف از ژنوم باکتری و کاست مقاومت آنتی بیوتیکی از پلاسمیدa(+) pET28¬، تکثیر یافته و به یکدیگر اتصال یافتند. قطعه حاصله با استفاده از آنزیم¬های محدودالاثر که توالی آنها در انتهای ´5 پرایمرهای خارجی قرار داده شده است، در جایگاه اختصاصی از پلاسمید pBluescriptIISK(-) همسانه سازی شده و پس از حصول اطمینان از عدم ایجاد جهش خودبخودی در حین مراحل PCR، با استفاده از روش الکتروپوریشن به داخل ژنوم بروسلا آبورتوس انتقال یافت. همسانه سازی محصول PCR اتصالی که بدون بروز تغییر در توالی نوکلئوتیدی حاصل شده بود، داخل پلاسمید pBluescriptIISK(-) انجام شد و پس از انتقال الکتریکی پلاسمید به ژنوم بروسلا آبورتوس، طی عمل ریکامبینیشن باعث جهش در ژن مورد نظر گردید. سویه موتان یافته به گروه های مختلف موش ها تزریق شد و سپس به منظور بررسی میزان تکثیر لنفوسیت ها به عنوان شاخصی از ایمنی سلولی و نیز تولید و یا عدم تولید ایمنوگلوبولین M که عامل مداخله گر در تست های تشخیصی می باشد اقدام به انجام تست¬های MTT و Elisa شد. نتایج این مطالعه نشان می دهد که حذف ژن هدف و جایگزین شدن آن با کاست کانامایسین با موفقیت انجام پذیرفت که رشد سویه در محیط واجد کانامایسین تائیدی بر صحت مطالب بیان شده می باشد. تزریق داخل پریتوئن سویه به موش ها و نیز مقایسه نتیجه حاصله با سویه¬های واکسینال صورت پذیرفت. انجام آزمون الایزا و ردیابی آنتی بادی IgM ضد بروسلا آبورتوس بر روی سرم موش های تحت تزریق، نشان دهنده اختلاف در جذب نوری سویه موتان با سویه 19S بوده که این نتیجه، گویای این مطلب می باشد که سویه موتان مذکور همانند سایر گونه های بروسلا که ژن مشابه در آنها حذف شده است، توانایی در تحریک تولید IgM که همان آنتی بادی مداخله گر در تست-های تشخیصی سرولوژی می باشد را ندارد. همچنین بررسی نقش سویه در تحریک سلول های چند هسته ای طحال، حاکی از عدم کاهش قدرت سویه در تحریک سیستم ایمنی سلولی بود و میزان تحریک این سلول ها تفاوت معناداری بین گروه های 19S و 51RB نشان ندادند و این میزان در سویه موتان، کمتر از سویه 19S و نیز بیشتر از سویه 51RB بوده است که می تواند نتیجه ای مطلوب در جهت تحریک سیستم ایمنی بدن و فعال شدن سلول های طحال باشد که خود می تواند ترشح فاکتورهای ایمنی زا را در پی داشته باشد.
- Abstract
- Brucella species are facultative, intracellular, Gram-negative bacteria with marked tropism for the pregnant reproductive tract of domestic animals. The pathogenicity of brucella is due to its ability to adapt to the environmental conditions encountered in its intracellular replicative niche including low levels of nutrients and oxygen, acidic pH and reactive oxygen intermediates. All Brucellaspecies establish persistent infection in the reticuloendothelial system of their natural hosts. Currently, only three live attenuated vaccines for thecontrol of B. abortus infection in cattle are recommended:B. abortus 45/20, B. abortus strain 19 (S19), and B. abortusRB51. B. abortus strain 45/20 was isolated followingtwenty passages in guinea pigs; this rough strain is used onlyas heat-killed vaccine to avoid reversion to a virulent strain.Also this vaccine needs to be administrated with an adjuvantin adult cattle; it does not interfere with serological diagnosisand it is safer in pregnant animals but only has been tested insome countries. The live vaccine B. abortus RB51 is a spontaneous rough mutant obtained by subculturing the virulent strain B. abortus2308 on medium containing rifampicin and penicillin. Subsequently, it was found to contain an IS711 elementdisrupting the wboA gene encoding a glycosyl transferase responsible for O-side chain synthesis. Another licensed live smooth attenuated vaccine forcontrol of bovine brucellosis is B. abortus S19. This strainwas isolated in the early twentieth century and was naturallyattenuated when a virulent culture of B. abortus was left atroom temperature for one year. B. abortus S19 has beeneffective for the control of brucellosis in adult bovine and prevents abortion as well as decreasing the prevalence inherds. However due to the smooth nature of the strain S19 and the strong antibody response against the O-side chain, it does not permit discrimination of infected from vaccinatedanimals. In this study, gene deletion in B. abortus S19 is caused in order to overcome this defect in the way of diagnostic tests, with minimal changes in the stimulation of immune system. For this purpose, employ gene knockout technique in B. abortus S19 to attain the attenuated mutant strain. Therefore, we deleted the Mannosyltransferase gene encoding (WbkA), one of the LPS O-chain coding genes, by Overlap Extension PCR. The procedure requires a total of four PCR reactions: three standard PCR reactions and one fusion PCR reaction. These include one reaction to amplify the marker of choice, kanamycine resistance gene from pET28a (+), and two reactions to amplify the regions flanking the site of marker insertion in the disruption target. The fusion PCR reactions fuse the marker gene to upstream and downstream flanking segments to produce gene disruption construct. Fusion PCR product was inserted into pBluescriptIISK(-) through XhoI, XbaI cut sites that carried by flanking primers. The resulting plasmid was cloned in E.coli DH5?. The gene disruption plasmid was introduced into B. abortus S19 by electroporation method and transformants were selected based on its resistance to kanamycin. The WbkA::?kan mutation was confirmed by PCR using internal and flanking primers. Four groups of twelve mice were injected i.p. with 2×106 CFU of either B. abortus RB51, S19 vaccines, mutant strainsand control in 0.2 mL of Phosphate Buffer Saline (PBS). To Measurement of IgM in the serum of mice, 12 animals from each group were examined at 0, 7, 14 and 21 days postinfection. For MTT test, 12 animals from each group were examined at 0, 7, 14, 21 and 28 days postinfection. The results of this study show that the Overlap Extension PCR is an optimized and modified technique to create mutations in the bacterial genome structure and can easily be used in the family Brucella. The ELISA test results showed the lack of stimulating immune system to secrete IgM in the group treated with the mutant strain, MTT assay results showed no significant between the groups in the polymorphonuclear leukocytes proliferation. Keywords: Brucella abortus S19, WbkA, Mutation
