عنوان پایان‌نامه
تعیین ژنوتایپ و اینتگرون گروه A جدایه های سودوموناس آئروژینوزا دامی و انسانی و بررسی فراوانی ژنهای حدت اگزوتوکسین A ، اگزوآنزیم S ، آلژینات و oprL و oprI
- رشته تحصیلی
- باکتری شناسی
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه دانشکده دامپزشکی شماره ثبت: 678 ت;کتابخانه دانشکده دامپزشکی - مخزن مرد آباد شماره ثبت: 678 ت;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 76665;کتابخانه دانشکده دامپزشکی شماره ثبت: 678 ت;کتابخانه دانشکده دامپزشکی - مخزن مرد آباد شماره ثبت: 678 ت;
- تاریخ دفاع
- ۰۷ مهر ۱۳۹۵
- دانشجو
- علیرضا مختاری
- استاد راهنما
- تقی زهرائی صالحی
- چکیده
- ضرورت انجام مطالعه: باکتری فرصت طلب سودوموناس آئروژینوزا مهمترین عامل عفونت‌های مختلف بیمارستانی و ورم پستان در گاوهای شیری می‌باشد. توانایی تولید عوامل حدت مختلف توسط این باکتری یک فاکتور مهم بیماریزا در پایه گذاری عفونت‌های مزمن و ایجاد مقاومت آنتی بیوتیکی محسوب می‌شود. هدف مطالعه: ژنوتایپ سویه های سودوموناس آئروژینوزای جداشده از انسان و دام با تکنیکهای ملکولی، شناسایی اینتگرون های کلاس A و بتالاکتامازها، تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی باکتری سودوموناس آئروژینوزا وحضورژنهای-حدت اگزوتوکسین A، اگزوآنزیم S و آلژینات، همچنین حضور ژنهای oprI و oprL درکلیه نمونه ها موردبررسی قرارگرفت. مواد و روش کار: در این تحقیق 50 سویه انسانی و 50 سویه دامی از سودوموناس آئروژینوزا مورد بررسی قرار گرفت. در بررسی عوامل حدت باروش Multiplex PCR جهت تشخیص ژنهای اختصاصی و از روش ERIC-PCR ,PFGE جهت ژنوتایپ استفاده شد. همچنین آزمایش دیسک دیفیوژن و E-test بر اساس روش CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) با آنتی بیوتیکهای مختلف انجام شد. یافته ها: تست حساسیت آنتی بیوتیکی به روش E-test برای 6 آنتی بیوتیک مروپنم، ایمی پنم، سفکسیم، آمیکاسین، جنتامایسین و سفپیم بر روی برخی از جدایه‌های منتخب دامی سودوموناس آئروژینوزا صورت گرفت. کمترین میزان غلظت داروهای مورد استفاده مربوط به داروی سیپروفلوکساسین با غلظت 125/0 میکروگرم و بیشترین میزان غلظت موثره را آنتی بیوتیک آمیکاسین با غلظت 8 میکروگرم در بین نمونه های دامی از خود بروز دادند. این تست حساسیت برای 6 آنتی بیوتیک مروپنم، ایمی پنم، سفکسیم، آمیکاسین، جنتامایسین و سفپیم بر روی برخی از جدایه‌های منتخب انسانی سودوموناس آئروژینوزا صورت گرفت. کمترین میزان غلظت داروهای مورد استفاده مربوط به داروی آمیکاسین با غلظت 1/0 میکروگرم و بیشترین میزان غلظت موثره را آنتی بیوتیک ایمی پنم با غلظت 8 میکروگرم در بین نمونه های انسانی از خود بروز دادند. همچنین کلیه نمونه های مورد بررسی در این آزمون نسبت به آنتی بیوتیک مروپنم دارای مقاومت بوده اند. بررسی 51 جدایه دامی سودوموناس آئزوژینوزا نسبت به 10 آنتی بیوتیک مختلف نشان داد که بیشترین میزان میزان مقاومت نسبت به داروهای آمپی سیلین (100%) وجود دارد. حساسیت کامل (100%) نسبت به آنتی بیوتیکهای ایمی پنم، سیپروفلوکساسین، اتروفلوکساسین، جنتامایسین و آمیکاسین مشاهده شد. الگوی حساسیت و مقاومت 51 جدایه انسانی سودوموناس آئزوژینوزا نسبت به 10 آنتی بیوتیک مختلف با روش دیسک دیفیوژن بیشترین میزان مقاومت نسبت به آنتی بیوتیکهای آمپی سیلین و سفپیم (100 % مقاوم)، و کمترین میزان آن نسبت به داروی آمیکاسین (9/9 %) مشاهده شد. بیشترین میزان حساسیت نیز به آنتی بیوتیک آمیکاسین با 3/80% قرائت شد. بر اساس نتایج به دست آمده مشخص گردید که 17 الگو متفاوت از نمونه های دامی در دندروگرام حاصل از روش ERIC-PCR وجود دارد. بیشترین تعداد نمونه ها متعلق به گروه P بوده با 14 ایزوله بوده است و 28% از نمونه ها را شامل شده که بیشترین شباهت‌ها را داشته اند. بر اساس نتایج به دست آمده مشخص گردید که 22 گروه متفاوت از الگوهای نمونه های انسانی با cut off 65% در دندروگرام وجود دارد. بیشترین تعداد نمونه ها متعلق به گروه M بوده با 8 ایزوله بوده است و 16% از کل نمونه ها را شامل می شوند، که بیشترین درصد تشابه را داشته اند بر اساس نتایج به دست آمده، شیوع ژن OPR-I بیشتر از سایر ژن‌ها بوده و در 100 درصد جدایه‌های انسانی سودوموناس آئروژینوزای بررسی شده وجود داشت. با این حال تمام نمونه‌ها از نظر وجود ژن ALG-D منفی بودند. برخلاف نمونه‌های انسانی، فراوانی اگزوآنزیم‌ها در نمونه‌های دامی خیلی کمتر بوده است. تمامی نمونه‌ها از نظر وجود اگزوآنزیم S منفی بودند و فقط اگزوآنزیم Y در 15 جدایه (25%) و اگزوآنزیم U و T در (6/68%) شناسایی شد. در جدایه‌های انسانی سودوموناس آئروژینوزای بررسی شده از نظر وجود ژنهای اگزوآنزیم‌های Y ، U ، T و S ، اگزوآنزیم T از بیشترین فراوانی برخوردار بود. به گونه ای که 100 % نمونه‌ها از نظر این اگزوآنزیم مثبت بودند. نمونه‌های دامی سودوموناس آئروژینوزا از نظر وجود اینتگرون نسبت به نمونه‌های انسانی، فراوانی کمتری داشته و صرفا یک نمونه (96/1%) از نظر ژن اینتگرون مثبت گزارش شد. تست Multiplex-PCR صورت گرفته با پرایمرهای VEB و GESجهت شناسایی ژنهای بتالاکتاماز کلاس A بر روی نمونه‌های انسانی سودوموناس آئروژینوزا با پرایمرهای اختصاصی مشخص گردید که صرفا در 2 نمونه (9/3 %) حاوی ژن VEB بوده اند. این تست با پرایمر GES برای تمامی نمونهای انسانی منفی گزارش شد. همچنین هیچ یک از نمونه‌های دامی واجد این دو ژن نبوده اند. بحث و نتیجه گیری: با توجه به اهمیت شناسایی سریع باکتری سودوموناس آئروژینوزا و با توجه به مشکلات موجود در روشهای بیوشیمیایی، روشهای مولکولی مانند PCR روشی حساس و سریع در شناسایی این باکتری می‌باشد. به علاوه شناسایی همزمان چند فاکتور ویرولانس با روش Multiplex PCR ویژگی بالایی به این کار می‌بخشد.
- Abstract
- The need to study: The bacteria Pseudomonas aeruginosa is an important opportunistic infections and mastitis in dairy cows is different hospital. The ability to produce various virulence factors by pathogenic bacteria, an important is created factor in establishing chronic infections and antibiotic resistance. Objective: Genotyp Pseudomonas aeruginosa strains isolated from human and animal and molecular techniques to identify Integrons of class A and beta-lactamases, determination of antibiotic susceptibility of Pseudomonas aeruginosa and the presence of virulence genes examined exotoxin a, Exoenzyme S and alginate, as well as oprI and oprL genes in all samples. Materials and Methods: In this study, was investigated 50 strains of human and 50 animal strains of Pseudomonas aeruginosa. In the study of virulence factors by Multiplex PCR method to detect specific genes and ERIC-PCR, PFGE was used to genotype. The disc diffusion and E-test based on CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) was performed with antibiotics. Results: Antibiotic susceptibility testing by E-test for six antibiotics was a trap meropenem, imipenem, cefixime, amikacin, gentamicin and cefepime on some selected isolates of Pseudomonas aeruginosa. The lowest concentration of drug used at a concentration of 0.125 mcg ciprofloxacin and amikacin antibiotic highest concentration of the active ingredient at a concentration of 8 micrograms of the samples showed their livestock. This sensitive test for six antibiotics meropenem, imipenem, cefixime, amikacin, gentamicin and cefepime on some selected isolates of Pseudomonas aeruginosa was human. The lowest concentration of drug used at a concentration of 0.1 mg amikacin and the highest concentration showed themselves of the active ingredient at a concentration of 8 mg imipenem antibiotics in human samples. All samples are also examined in this test of resistance to antibiotics meropenem. Animal isolates of 51 Pseudomonas reviews to 10 different antibiotics showed that the highest rates of drug resistance to ampicillin (100%) there. Full sensitivity (100%) compared to the antibiotic imipenem, ciprofloxacin, enrofloxacin, gentamicin and amikacin, respectively. Susceptibility and resistance pattern in 51 human isolates of Pseudomonas to 10 different antibiotics by disk diffusion method was observed the highest resistance to the antibiotics ampicillin and cefepime (100% proof), and the lowest to drugs amikacin (9 / 9%). The highest sensitivity was read to antibiotics amikacin with 80.3%. The results obtained showed that 17 different patterns of animal specimens in Dendrogram there ERIC-PCR method. Most of the samples belonging to the group P has been isolated with 14 and 28% of the samples included with the most similarities. The results obtained showed that 22 different sets of patterns of human samples are cut off 65% in cluster analysis. Most of the samples belonging to Group M has been isolated by 8 and 16% of the total samples included attending And the highest percentage of similarity based on the results, prevalence of OPR-I greater was investigated than other genes and are 100% human isolates of Pseudomonas aeruginosa. However, all samples were negative for the presence of ALG-D gene. Unlike human, animal abundance in the sample exoenzyme been much lower. All samples were negative for the presence of exoenzyme S and exoenzyme Y only 15 isolates (25%) and exoenzyme U and T were identified in (68.6%). In human isolates of P. aeruginosa check for the presence of genes exoenzyme of Y, U, T and S, T exoenzyme of the most abundant. So that 100% of the samples were positive for the exoenzyme. Integrons animal specimens to human specimens for the presence of Pseudomonas aeruginosa, a lot less, and only one (1.96%) were positive for the gene Integrons. Multiplex-PCR test to detect beta-lactamase genes were amplified by VEB and GES Class A Pseudomonas aeruginosa with specific primers on human subjects showed that only 2 cases (3.9%) VEB genes. The test of primer GES for all human samples were negative. Also, none of these genes were not eligible animal samples. Conclusion: Considering the importance of rapid identification of Pseudomonas aeruginosa and due to problems in biochemical, molecular methods like PCR is a sensitive and rapid detection of this bacterium. In addition, the identification of several virulence factors with high specificity to this work gives Multiplex PCR method. Keywords: Pseudomonas aeruginosa, Multiplex-PCR, Antibiotic resistance, PFGE, ERICPCR
