عنوان پایان‌نامه
ساخت نانو ذرات لییدی جامد حاوی تیل مایکوزین ، ارزیابی برون تنی خواص فیزیکوشیمیایی و ضد باکتریایی دارو و فارماکوکینتیک آن در جوجه های گوشتی متعاقب تجویز خوراکی
- رشته تحصیلی
- بهداشت آبزیان
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه دانشکده دامپزشکی شماره ثبت: 682 ت;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 77026;کتابخانه دانشکده دامپزشکی - مخزن مرد آباد شماره ثبت: 682 ت;کتابخانه دانشکده دامپزشکی شماره ثبت: 682 ت;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 77026;کتابخانه
- تاریخ دفاع
- ۱۸ آبان ۱۳۹۵
- دانشجو
- علوان عبدحمادی الکشاوی
- استاد راهنما
- علی رسولی
- چکیده
- مقدمه: داروی ضدمیکروب به ترکیب شیمیایی اطلاق می‌شود که از طریق دخالت در رشد میکروارگانیسم‌ها، آنها را از بین برده یا از رشد آنها جلوگیری می‌کند (ژانگ و همکاران 2010). روش‌های درمانی ضدمیکروبی رایج شامل استفاده از عوامل شیمی درمانی یا آنتی بیوتیک هاست که برای درمان بیماریهای مسری بکار گرفته می‌شوند (رنگار و همکاران 2010). آنتی بیوتیک ها ممکن است دارای محدودیت‌هایی باشند از جمله طیف باریک فعالیت‌های ضدمیکروبی، مشکلات مربوط به سلامت دارو و اینکه ممکن است به اثرات نامطلوب خطرناکی مانند سمیت یا آلرژی در میزبان منجر شود. دارورسانی ناکافی آنتی بیوتیک ها نیز یکی از محدویت های مهم در درمان توسط داروهای ضدمیکروب مرسوم است. از این گذشته، یک محدودیت مهم و اساسی درمان توسط ضدمیکروب ایجاد مقاومت باکتریایی نسبت به آنتی بیوتیک است (رنگار و همکاران 2014). تیل مایکوزین یک داروی ضدمیکروب ماکرولیدی نیمه ساختگی و مشتق داروی تایلوزین است. این دارو برای درمان بیماریهای تنفسی مؤثر زیادی دارد و این اثر به خاطر تجمع آن در بافت ریوی است. تیل مایکوزین مشکلاتی دارد از جمله قدرت اثر پایین، دارای سمیت نسبی و جذب ضعیف از راه خوراکی. با در نظر گرفتن این معایب، توسعه سیستم جدیدی برای دارورسانی تیل مایکوزین ضروری است. تیل مایکوزین یک داروی ضد میکروبی وسیع الطیف است که فقط برای مصارف دامپزشکی است. این دارو برای درمان بیماریهای تنفسی به ویژه در طیور و گاو استفاده می‌شود. این دارو عمدتاً علیه گونه های مختلف مایکوپلاسما و پاستورلا و چندین باکتری گرم مثبت مانند گونه های استرپتوکوک و استافیلوکوک مؤثر است (السید و همکاران 2014، ایراسلان 2007). به طور کلی باکتری های گرم منفی انتروباکتریاسه در دوز پایین به تیل مایکوزین مقاوم هستند، در نتیجه دارو باید با دوز بالا مصرف شود تا بتواند در این باکتری ها موثر واقع شود. بنابراین، تیل مایکوزین علیه عفونت ناشی از این اجرام استفاده نمی‌شود (جوردن و هوراک 1996). علاوه بر این، تیل مایکوزین اثرات زیانباری نیز دارد که از اختلالات گوارشی ویرقان تا سمیت قلبی و مرگ و میر گسترده است (یازار و همکاران 2001، مین و همکاران 1996). اخیراً در حوزه داروسازی، بکارگیری سیستم‌های ذره‌ای کوچکتر از میکرون برای دارو رسانی از راه خوراکی مورد توجه زیادی قرار گرفته است. الگوی رهایش کنترل شده دارو در این سیستم‌ها، اثرات تخریبی مجرای گوارشی روی داروهای کپسوله شده را کاهش می‌دهد (آلبریک و همکاران، 2002، دامجی و همکاران 1990) و از این طریق جذب و انتقال داروها از مخاط روده را افزایش می‌دهد (توبیو و همکاران 2000). زیست فراهمی داروها از راه خوراکی به شدت تحت تأثیر میزان حلالیت و نفوذپذیری آن هاست، زیرا این عوامل از عناصر مهم تعیین کننده جذب دارو به شمار می روند (پلاپید و همکاران 2011). میزان زیست فراهمی خوراکی دارو، معمولاً اثربخشی آن را تعیین می‌کند بخاطر این که این شاخص شروع اثر، شدت اثر و مدت عمل دارو را تعیین می‌کند (ابو باشا و همکاران 2007). کاهش اندازه ذرات داروها برای افزایش انحلال دارو و فراهمی خوراکی آن ها امیدوار کننده بوده است. زیرا این عمل، دارورسانی به محل و زمان مناسب را تسهیل می‌کند. فرآورده های نانوذرات را می‌توان با استفاده از مواد تجزیه پذیر مانند لیپیدها تهیه کرد (چن و همکاران 2014). نانوذرات لیپیدی را می‌توان پس از تبدیل به پودر به صورت خوراکی مصرف کرد. آنها به انحلال و محلول شدن دارو از طریق محافظت آنها در محیط لوله گوارش کمک کرده و اختلاط آنها را با عوامل محلول کننده مجرای گوارش مانند اسیدهای صفرا تسهیل می‌کنند. از این گذشته، نانوذرات لیپیدی با خاصیت رهاسازی مستمر، دارو را از تخریب حفظ می‌کند و پایداری آنها را در مجرای گوارش بهبود می‌بخشند (باتاگلیا و گالارات 2012). نانوذرات لیپیدی پتانسیل زیادی برای تجویز ملکول های فعال دارویی از هر راه تجویز را دارند و مزیت آن ها شامل خودداری از بروز سمیت ناشی از حلال آلی و میزان بارگذاری زیاد دارو در فرآورده است. همچنین از آنها می‌توان برای بهبود زیست فراهمی دارو و به دست آوردن فرآورده های آهسته رهش استفاده کرد (خی و همکاران، 2008، مولر و همکاران 2000). ? اهمیت پروژه: نتایج بالینی درمان ضدمیکروبی به حساسیت ارگانیسم‌ها و فعالیت دارو که با حداقل غلظت مهاری نشان تعیین می شود (فارماکودینامی)، میزان توانایی دارو در رسیدن به هدف به غلظت کافی و به مدت کافی (فارماکوکینتیک) و همچنین توانایی دارو در از بین بردن عامل بیماریزا بدون آسیب به میزبان (سمیت انتخابی) بستگی دارد. تیل مایکوزین یکی از جدیدترین ماکرولیدهایی است که برای مصرف دامپزشکی معرفی شده است. تاکنون برای چند گونه حیوانی مولد غذا مجوز دریافت کرده است و برای کاربرد خوراکی و تزریقی موجود است. با این حال، فرآورده تزریقی تیل مایکوزین در حیوانات می تواند عوارض بیشتری از جمله اسهال و سمیت قلبی داشته باشد. از این گذشته، تحقیقات محدودی در مورد زیست فراهمی خوراکی تیل مایکوزین در طیور وجود دارد. در حال حاضر، فسفات تیل مایکوزین محلول (تیل مایکوزین فسفات) در پرورش طیور استفاده می‌شود ولی این فرم قدرت اثر پایین و زیست فراهمی نسبتا" کمی دارد. با آگاهی از این معایب، ایجاد سیستم جدید دارورسانی برای تیل مایکوزین ضروری است. فورمولاسیون های نانوذرات لیپیدی مانند نانوذرات لیپیدی جامد (SLN)، حامل های لیپید نانوساختار (NLC) و نانوکپسولهای با هسته لیپیدی (LNC)، نانو امولسیون ها و نانوکریستال ها، سیستم‌های دارو رسانی مبتنی بر نانوحامل لیپیدی تجزیه پذیر هستند. با قرار دادن دارو در نانوذرات لیپیدی، ویژگی های فیزیکوشیمیایی، پایداری در زمان نگهداری دارو بعد از انجماد خشک، فعالیت ضدباکتریایی، پارامترهای فارماکوکینتیک و شاخص درمانی داروها را می‌توان به طور قابل توجهی در مقایسه با داروهای متداول بهبود بخشید. این مزایا را می‌توان از طریق بهبود حلالیت داروها، افزایش مدت زمان گردش سیستمیک، رهاسازی آهسته و کنترل شده دارو، دارورسانی ترجیحی به بافتها و سلول های هدف بدست آورد. در این تحقیق، راه تجویز خوراکی انتخاب شد زیرا تنها مسیر آسانی است که درمان گله ای در حیوانات را ممکن می‌کند. نتایج: ویژگی های فیزیکوشیمیایی نانوذرات لیپیدی حاوی تیل مایکوزین: میانگین قطر ذرات (MD) سوسپانسیون‌های مختلف آماده شده تفاوت معنی داری نشان داد گرچه مقادیر همگی در مقیاس نانو (85-186 نانومتر) بود. در میان سوسپانسیون ها نانوکپسول با هسته لیپیدی حاوی تیل مایکوزین کمترین مقدار قطر ذرات را داشت (0/1 ± 0/85). مقادیر PDI همه فورمولاسیون ها کمتر از 0/1 بود که بر وجود یک سیستم با اندازه پراکندگی یکسان دلالت دارد. مقادیر PDI برای همه فورمولاسیون ها کمتر از 3/0 بود. مقادیر ZP همه فورمولاسیون های آماده شده منفی بود و حامل لیپیدی نانوساختار حاوی تیل مایکوزین به طور معنی داری منفی‌تر بود (51/2 ± 3/29- میلی ولت). مورفولوژی: اندازه ذرات در پودر خشک فورمولاسیون های انجماد خشک تهیه شده با مانیتول %5 همگی در مقیاس نانو بودند. ذرات نانوکپسول با هسته لیپیدی حاوی تیل مایکوزین نسبتاً کروی بودند و شکل منظم داشتند. ذرات حامل لیپیدی نانوساختار حاوی تیل مایکوزین نیز کروی شکل و تا حدی شبیه پلاکت بودند. نانوذرات لیپید جامد حاوی تیل مایکوزین در مقیاس نانومتر و دارای سطحی با بافت نرم و به شکل کروی بودند. انجماد خشک (لیوفیلز کردن): بعد از انجماد خشک تغییرات اندکی در فورمولاسیون های انجماد خشک در مقایسه با سوسپانسیون ها به دست آمد. این فورمولاسیون ها پودر نرمی تولید کردند و بعد از بازسازی، محلول های همگن با اندکی افزایش در میانگین قطر ذرات حاصل شد (64/2 ± 0/193 ، 63/7± 6/156 و 63/7 ± 6/116 نانومتر به ترتیب برای نانوذرات لیپید جامد، حامل لیپیدی نانوساختار و نانوکپسول با هسته لیپیدی) و در ضمن با تغییرات اندک در مقادیر شاخص پراکندگی اندازه ذرات و پتانسیل زتا همراه بودند. همچنین مقادیر ظرفیت بارگذاری و کارآیی کپسوله کردن دارو قبل و بعد از انجماد خشک مشابه بودند. پایداری در دوره نگهداری: همه فورمولاسیون های انجماد خشک در پایان هفته هشتم به خوبی در آب پراکنده شدند. مقادیر میانگین قطر ذرات در دامنه 117-306 نانومتر و مقادیر شاخص پراکندگی اندازه ذرات بین 136/0 تا 513/0 بعد از هشت هفته در دمای 1±25 درجه سانتی گراد بودند. مانیتول باعث تولید پودر نرم و محلولی با خواص بهتر در دوره های مختلف ذخیره سازی (هفته چهارم و هفته هشتم) در دمای 2±4 و 1±25 درجه سانتی گراد شد. میزان کپسوله شدن دارو: حداکثر مقادیر کارآیی کپسوله شدن دارو و ظرفیت بارگذاری (که بلافاصله بعد از آماده سازی فرآورده ها بررسی شد) با فورمولاسیون نانوکپسول با هسته لیپیدی حاوی تیل مایکوزین بدست آمد. بعد از انجماد خشک، مانیتول به طور نسبی مقادیر بالاتری در مقایسه با دیگر مواد محافظ انجماد خشک فراهم نمود. بررسی رهاسازی دارو در محیط آزمایشگاهی: رهاسازی دارو در فرآورده تیل مایکوزین استاندارد در مدت 12 ساعت در pH 4/7 و 2/1 به ترتیب 97 و 100 درصد بود، ولی فورمولاسیون های دیگر مدل رهاسازی دوفازی را نشان دادند که با رهاسازی اولیه و سپس رهاسازی مداوم همراه بود. سوسپانسیون‌ها نانوذرات لیپیدی حاوی تیل مایکوزین در مقایسه با پودرهایشان رهاسازی اولیه سریع‌تری نشان دادند. به طور کلی مشخص شد که مدت زمان رهاسازی برای حالت پودری و سوسپانسیون در pH 4/7 نسبت به pH 2/1طولانی‌تر بود. در pH 4/7 پودر های حامل لیپیدی نانوساختار و نانوکپسول با هسته لیپیدی بیشترین مدت زمان رهاسازی را داشتند (در 200 ساعت به طور کامل رها شد). فعالیت ضدمیکروبی: مشخص شد که استافیلوکوک اورئوس نسبت به فعالیت ضد میکروبی فورمولاسیون های ساخته شده حساستر بود. در میان فورمولاسیون های مطالعه شده، پودر نانوکپسول با هسته لیپیدی حاوی تیل مایکوزین و سوسپانسیون نانوکپسول با هسته لیپیدی حاوی تیل مایکوزین فعالیت ضدباکتریایی بیشتری علیه باکتریهای آزمایش شده از لحاظ قطر ناحیه مهار رشد نشان دادند. با وجود این، اولین نتایج نشان دهنده حساسیت اشریشیا کلای، با غلظت 4 میکروگرم بر میلی لیتر پودر و سوسپانسیون نانوکپسول با هسته لیپیدی حاوی تیل مایکوزین بدست آمد. به طور کلی، همه فورمولاسیون ها در غلظت 8 میکروگرم بر لیتر فعالیت ضدباکتریایی نشان دادند و پس از آن رشد باکتری به میزان بیشتری جلوگیری شد که این مسئله بر ارتباط فعالیت ضدباکتریایی داروی کپسول شده و قطر ذرات دلالت دارد. مقادیر حداقل غلظت مهاری و حداقل غلظت کشندگی مربوط به نانوذرات لیپید جامد حاوی تیل مایکوزین و تیل مایکوزین استاندارد علیه باکتری اشریشیا کلای سه برابر بیشتر از مقادیر استافیلوکوک اورئوس بودند. در حالی که حامل لیپیدی نانوساختار حاوی تیل مایکوزین و نانوکپسول با هسته لیپیدی حاوی تیل مایکوزین در افزایش فعالیت ضدباکتریایی تیل مایکوزین موفق تر بودند، با وجود این، مقادیر آنها در حالت پودری و سوسپانسیون قدری متفاوت بود. پارامترهای فارماکوکینتکی: تیل مایکوزین بدون ایجاد اثرات مضر قابل مشاهده توسط جوجه‌های گوشتی تحمل شد. حداکثر غلظت پلاسمایی دارو مربوط به نانوکپسول با هسته لیپیدی حاوی تیل مایکوزین به طور معنی داری بیشتر از مقادیر به دست آمده با تیل مایکوزین فسفات و دیگر فورمولاسیون های نانوذرات لیپیدی حاوی تیل مایکوزین بود (P<0.05). مقادیر شاخص های مختلف فارماکوکینتیک از جمله میانگین سطوح زیر منحنی غلظت – زمان، سطوح زیر منحنی غلظت لحظه اول- زمان، نیمه عمر حذفی، ثابت سرعت حذف، کلیرانس ، حجم پخش و میانگین زمان ماندگاری در پلاسما برای برای فورمولاسیون های مختلف به طور کلی تفاوت معنی دار داشتند (P<0.05). پارامترهای فارماکوکینتیک مربوط به نانوذرات لیپیدی حاوی تیل مایکوزین از تیل مایکوزین فسفات به طور معنی داری متفاوت بودند. در میان همه فورمولاسیون ها، نانوکپسول با هسته لیپیدی حاوی تیل مایکوزین مقادیر بهتری را نشان داد. مقادیر سطح زیر منحنی غلظت- زمان ساعت صفر تا بی نهایت) بعد از تزریق خوراکی نانوذرات لیپیدی حاوی تیل مایکوزین به طور معنی داری بیشتر از تیل مایکوزین فسفات بود (P<0.05). زیست فراهمی نسبی مربوط به نانوکپسول با هسته لیپیدی حاوی تیل مایکوزین تقریباً 7/6 برابر بیشتر از تیل مایکوزین فسفات بود. همجنین زیست فراهمی مربوط به فورمولاسیون های حامل لیپدیی نانوساختار و نانوذرات لیپدید جامد نیز به ترتیب 3/4 و 5/2 برابر بالاتر از تیل مایکوزین فسفات بود. در این آزمایش، مقادیر میانگین زمان ماندگاری در پلاسما و نیمه عمر حذفی مربوط به فورمولاسیون نانوذرات لیپیدی حاوی تیل مایکوزین به طور معنی داری بیشتر از مقادیر فرآورده تیل مایکوزین فسفات بود. نتیجه گیری: تیل مایکوزین به طور موثری در نانوذرات لیپیدی بارگذاری شد و بهترین خواص فیزیکوشیمیایی، ضد میکروبی و فارماکوکینتیک با فرآورده نانوکپسول با هسته لیپیدی حاوی تیل مایکوزین به دست آمد و در درجه بعدی، حامل لیپیدی نانوساختار حاوی تیل مایکوزین قرار داشت. مانیتول به عنوان محافظ انجماد در آزمایش های پایداری بهترین نتایج را در بر داشت. طولانی‌ترین دوره رهاسازی با استفاده از پودرهای حامل لیپیدی نانوساختار و نانوکپسول با هسته لیپیدی حاوی تیل مایکوزین در pH برابر با 4/7 به دست آمد. زیست فراهمی تیل مایکوزین به طور معنی داری با استفاده از نانوذرات لیپیدی خوراکی ( نانوذرات لیپید جامد حاوی تیل مایکوزین، حامل لیپیدی نانوساختار حاوی تیل مایکوزین و نانوکپسول با هسته لیپیدی حاوی تیل مایکوزین) در مقایسه با تیل مایکوزین فسفات معمولی در جوجه‌های گوشتی افزایش یافت. فورمولاسیون های جدید نانوذرات لیپیدی حاوی تیل مایکوزین افزایش مقادیر سطوح زیر منحنی غلظت- زمان، حداکثر غلظت پلاسمایی ، زمان رسیدن به حداکثر غلظت پلاسمایی و میانگین زمان ماندگاری در پلاسما را مرتبط با اندازه ذراتشان، بارهای سطح ذره، لیپید و ترکیب سورفکتانت نشان دادند. بهترین نتایج زیست فراهمی دارو در مقایسه با تیل مایکوزین فسفات، با فورمولاسیون نانوکپسول با هسته لیپیدی به دست آمد و پس از آن حامل لیپیدی نانوساختار قرار داشت. به نظر می‌رسد که سیستم دارورسانی هیبرید (فورمولاسیون نانوکپسول با هسته لیپیدی) می‌تواند برای دستیابی به فورمولاسیون با رهاسازی پایدار تیل مایکوزین همراه با فعالیت ضدباکتریایی بیشتر و سمیت دارویی کمتر امیدوار کننده تر باشد. گرچه تحقیقات بیشتری در این زمینه مورد نیاز است.
- Abstract
- Tilmicosin (TLM) is an important semi-synthetic antibiotic in veterinary medicine with relatively poor bioavailability and dose-dependent toxicity. This study aimed to formulate three TLM-loaded lipid nanoparticles (TLM-LNPs); including solid lipid nanoparticles (SLNs), nanostructured lipid carriers (NLCs) and lipid-core nanocapsules (LNCs). Additionally, the physicochemical properties of the TLM-LNPs, storage stability after lyophilization, antibacterial activity and their pharmacokinetics (PK) of oral dosing in broiler chickens were evaluated. Particle size mean diameter (MD), polydispersity index (PDI), zeta potential (ZP), drug encapsulation efficiency (EE), loading capacity (LC), and morphology of formulations were assessed. Effects of various cryoprotectants during lyophilization and storage at 4°C and 25°C for 8 weeks were studied. TLM release profiles and antibacterial activities of these TLM-LNPs suspensions (against Escherichia coli and Staphylococcus aureus) were also evaluated and compared with their powders. To do PK study sixty chickens, were divided into eight groups. Four treatment groups (n=10) given a single oral dose of different TLM formulations (one group dosed tilmicosin phosphate TLM-PH and three groups dosed with LNPs formulations), four control groups (n=5) received the vehicles or distilled water. Plasma TLM concentrations were assayed after an oral administration by HPLC method and its PK parameters (Cmax, Tmax, AUC0–?, AUMC0-120, t1/2, kel, Cl/F, MRT Vd/F and Rel.BA) were calculated using non-compartmental analysis. The results showed that, TLM-LNPs suspensions were in nano-scale range. For TLM-SLNs, TLM-NLCs and TLM- LNCs, the MD values were 186.3±1.5, 149.6±3.0 and 85.0±1.0 nm; ZP values were -18.9, -29.3 and -17.3 mv and EE values were 69.1, 86.3 and 94.3%, respectively. TLM-LNCs gave the best results with significantly low particle size and high EE (p<0.05). These values were significantly changed (p<0.05) after lyophilization. Mannitol was the most effective cryoprotectant for lyophilization and storage of TLM-LNPs. The drug release profiles were biphasic and the release times were longer at pH 7.4 where TLM-NLCs and TLM-LNCs powders showed longer release times. In microbiological tests, S. aureus was about 4 times more sensitive than E. coli to TLM-LNPs with minimum inhibitory concentration ranges of 0.5-1.0 and 2-4 µg/ml, respectively, and among them, the TLM-LNCs exhibited the best antibacterial activities. The relative bioavailability (Rel.BA) of TLM-SLNs, TLM-NLCs and TLM-LNCs were 2.51, 4.31 and 6.69 times more than TLM-PH, respectively. Cmax values, were 1.26±0.26, 1.58±0.42, 1.76±0.37 and 1.97±0.40 ?g/ml, respectively. Tmax mean values were also 2.4, 5.6, 4.8 and 12.0 h, respectively. In conclusion, TLM can be effectively loaded in LNPs formulations especially TLM-LNCs and TLM-NLCs, which are promising carriers for TLM with better drug encapsulation capacity, release behavior and antibacterial activity. The PK study also indicated that the LNPs improved TLM bioavailability and PK parameters especially LNCs formulation, so these LNPs could be considered as promising delivery systems for TLM and suggest more efficient medications compared with the conventional TLM. Keywords: Tilmicosin, Lipid nanoparticles, Stability, Antibacterial activity, pharmacokinetics, broiler chicken.
