عنوان پایان‌نامه
طراحی و سنتز نانوسامانه آپتامری،بر پایه نانو ذرات طلابه منظور جداسازی و شناسایی رده سلولی ۱۱۶ HCT (مرتبط با سرطان کولون)
- رشته تحصیلی
- نانوبیوتکنولوژی
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه دانشکده علوم و فنون نوین شماره ثبت: 302790;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 77228;کتابخانه دانشکده علوم و فنون نوین شماره ثبت: 302790;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 77228
- تاریخ دفاع
- ۲۹ اردیبهشت ۱۳۹۵
- دانشجو
- مژگان احمدزاده راجی
- استاد راهنما
- قاسم عموعابدینی
- چکیده
- مشاهده زودهنگام سلول های متاستازشده توموری در خون، جهت رصد و جلوگیری از توسعه سرطان به بافت های دیگر اهمیت دارد. بدین منظور ساخت سیستم های شناسایی با استفاده از فنآوری نانو و بیو توسعه پیداکرده است. از میان مولکول‌های تشخیصی، آپتامرها با مزایای مقرون به صرفه بودن و کارآمدی در ساخت نانوسیستم های اختصاصی، ابزار مناسبی برای اتصال و شناسایی این سلول ها را فراهم می کند. در این تحقیق برای دستیابی به دانش فنی نانوسامانه جهت تشخیص سلول های متاستاز شده، از یک آپتامر تثبیت شده بر روی دو بستر متفاوت الکترود طلا و نانوذرات طلای تثبیت شده رویITO استفاده شد. به این منظور ابتدا یک نانوسامانه بدون نشانگر برای تشخیص سلول HCT 116 به عنوان سلول هدف و سلول HEp-2 به عنوان کنترل مورد استفاده قرار گرفت. این آپتامر اختصاصی برای بیومارکر کارسینوامبریونیک آنتی ژن است که در سطح سلول هدف بیان می شود. از آنجائیکه آپتامرها از هر دو انتها قابلیت اتصال به سطح را دارند برای طراحی این آپتامر، یک گروه هگزامتیلن آمین به عنوان رابط در انتهای´3، جهت اتصال کووالان به الکترود طلا و نانوذرات طلا به انتهای توالی آپتامر اضافه گردید. برای بررسی عملکرد نانوسامانه ( آپتامر+ اتصال دهنده+ الکترود طلا یا نانوذرات طلای نشانده شده روی سطحITO ) ؛ آپتامر در ناحیه ´5 با FITC نشاندار شده وجهت ارزیابی رده سلولی سرطان کولون HCT116 مورد بررسی قرار گرفت. نانوذرات طلا با روش احیای یون تتراکلرواورات توسط سدیم سیترات به عنوان روشی کلاسیک موجود در منابع ساخته شد. نتایج حاصل از تست هایی مانند فلئورسنت، فلوسایتومتری؛ 60/19درصد اتصال سلول های HCT116 را به آپتامر تائید کرد. ابعاد نانوذرات به طور متوسط باروش پراکندگی نورپویا (DLS) حدود 31 نانومتر و با روش زتا پتانسیل بار سطحی نانوذرات طلا 42/29 – میلی ولت تخمین زده شد. آپتامرها به صورت کووالان به سطح الکترود طلا به عنوان هدف اول و الکترود ITO پوشش داده شده با نانوذرات طلا به عنوان هدف دوم این تحقیق با کمک 11-MUA فعال شده با (EDC/NHS) متصل شد. ولتامتری چرخه ای (CV) و کرونوپتانسیومتری (CP)، برای اتصال نانوذرات روی سطح ITO مورد استفاده قرار گرفت. همچنین آنالیزهای الکتروشیمی اتصال آپتامر به سلول هدف و تست هایFE-SEM و الکتروشیمی،ترسیب الکتروشیمیایی نانوذرات طلا و اتصال سلول مدل به سطحITO پوشش داده شده روی شیشه را ثابت کرد. با تأیید اتصال سلول ها به آپتامر، توسط روش الکتروشیمی؛LOD برابر7سلول در میلی لیتر در بافرPBS برای نانوسامانه تثبیت شده روی الکترود طلا و 6 سلول درمیلی لیتر در مورد الکترود ITO محاسبه شد. مقایسه بین نتایج سلول سرطانی و کنترل در هردو الکترود نشان داد نانوسامانه کاملا گزینشی عمل می کند. در الکترود ITO برای سلول های کنترل، خروجی دستگاه پتانسیواستات ثابت و برابر 8 نانوآمپرگزارش شد و در اتصال به سلول های سرطانی مدل، با افزایش تعداد سلول ها، افزایش جریان بین ولتاموگرام های اتصال سلولی درالکترود ITO ازA? 26/38برای 6 سلول به A?63/71 برای غلظت 50 سلول در میلی لیتر افزایش پیدا کرد. در مورد الکترود طلا خروجی جریان دستگاه برای سلول کنترل ثابت و برابر A? 0/22 و جریان برای سلول مدل در غلظت های 6 و 50 سلول در میلی لیتر به ترتیب 0/2 و 0/5 میکروآمپرگزارش شد که با افزایش روبرو بود. مطابق مطالعات آماری به دست آمده در سه تکرار از هر مرحله پوشش دهی، بین نتایج اختلاف معنی دار مشاهده نشد که نشانگر تکرار پذیری آزمایش ها است. با توجه به نتایج حاصل به نظر می رسد طراحی و استفاده از نانوسامانه آپتامری متصل به طلا در یک نانو حسگر زیستی در جهت تشخیص رده سلولی مدل کاربردی می باشد و الکترود ITO بر اساس مزایای شفاف بودن و حد تشخیص کمتر برای سلول سرطانی مناسب تر به نظر می رسد.
- Abstract
- Early detection of circulating tumor metastasis cells calls for the design and implementation of emerging nano-bio-systems in order prevent the development of disease to other tissues. Among various bio-recognition elements, aptamers offer great advantages of cost-effective and efficient to develop such nano-bio-systems for cancer detection . Herein, in this study we synthesis an aptamer immobilized on the surface of gold electrodes and gold nano-particles immobilized on surface ITO. For this purpose, we investigated a label-free aptasensor for detecting of colon cancer cell using HCT116 as target cell and HE-p2 as control cells. An aptamer specific to carcinoembryonic antigen (CEA) presenting on the surface of colon cancer cells was employed to capture the colon cancer cell. Since both ends of the aptamers have the ability to connect to surface electrode, but an amine Hexamethylene as a linker attached to 3'-end of aptamer to interface for connecting covalently bound to a gold electrode and the gold nanoparticles was added to the aptamer sequence. To evaluate the performance nanosystem (aptamer + linker + gold or gold nanoparticles deposited on the surface of ITO electrode), the 5 ' end of aptamer labeled with FITC, used for evaluate HCT116 colon cancer cell line attachment. Gold nanoparticles synthesized by reduction tetrachloroaurate ion with sodium citrate as a classic method in the literature. The results of the test, such as fluorescence, flow cytometry, cells HCT116 connection to the aptamer approved the 60.19 percent attachment of aptamer to target cell. The average size of nanoparticles with Dynamic light scattering (DLS) method and zeta potential was about 31 nm and -42.29 mV respectively. Capture aptamers have been covalently immobilized on the surface of gold electrode in the first approach and on the surface gold nanoparticles (GNPs) in the second approach through self-assembly monolayer of 11-mercaptoundecanoic acid (11-MUA) activated with (EDC/NHS). The cyclic voltammetry (CV) and chronopotentiometry (CP) methods were also used to electrodeposit GNPs on the surface of indium tin oxide (ITO). In this work, the CV method is also used to demonstrate the conjugation of substrates and aptamers and identify the cancer cell capturing events. These measurement results shows (LOD=7) and (LOD=6) for Gold electrode and Gold nanoparticles immobilized on ITO respectively with high sensitivity and selectivity. Additionally, Field Emission Scanning Electron Microscopy (FE-SEM) confirmed the deposition of GNPs on ITO and the attachment of target cells on the aptasensor. The output of ITO electrode to control cells is constant and equal to 8 nanoamper and potentiostat output for cancer cells increased with number of cells from 26.38 ?A and 63.71 ?A for 6 and 50 cells per mL respectively. For Gold electrode the output for control and cancer cells was 0.2 and 0.5 ?A for 6 and 50 cell/mL respectively. According to statistical analysis there is no significant difference between the results obtained in the three replications of each step coverage which indicates repeatability tests. The results show design and using of aptameric nanosystem attached Gold in nanobiosensor based transparent ITO with lower LOD is applicable. Keywords: Aptamer, HCT 116 colon cancer cell line, Nano-biosensor, LOD (Limit Of Detection), ITO (Indium Tin Oxide), GNP (Gold Nanoparticles)
