عنوان پایان‌نامه
تعریف یک رقیق کننده بر پایه نانو ذرات لسیتین سویا برای انجماد اسپرم گاو هلشتاین
- رشته تحصیلی
- مهندسی کشاورزی - علوم دامی - فیزیولوژی دام
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی شماره ثبت: 7034;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 76233;کتابخانه مرکزی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی شماره ثبت: 7034;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 76233
- تاریخ دفاع
- ۲۸ شهریور ۱۳۹۵
- دانشجو
- سید مجتبی موسوی
- استاد راهنما
- آرمین توحیدی, مهدی ژندی
- چکیده
- مزایای استفاده از رقیق کننده های اسپرم بر پایه لسیتین سویا در اسپرم انسان، اسب، قوچ، سگ و بز گزارش شده است. رقیق کننده هایی برای اسپرم گاو نیز به طور تجاری تولید شده اند، اما اطلاع دقیقی در مورد ترکیب آنها در دسترس نیست. این رساله جهت ساخت یک رقیق کننده بر پایه نانو¬ذرات لسیتین سویا برای انجماد اسپرم گاو هلشتاین طراحی شد. نمونه های منی از شش راس گاو نر با واژن مصنوعی هفته ای دو مرتبه (از هر گاو شش انزال) جمع آوری شدند. این تحقیق در هفت مرحله انجام شد. در آزمایش اول، اثر تغییر ساختار لسیتین به نانو ذرات لسیتین و سطوح گوناگون لسیتین (یک، دو، سه و چهار درصد) برکیفیت اسپرم پس از فرآیند انجماد یخ گشایی ارزیابی شد. در آزمایش دوم، رقیق کننده ساخته شده بر پایه نانو ذرات لسیتین سویا با رقیق کننده ساخته شده بر پایه نانو لیپوزوم لسیتین و رقیق کننده تجاری مقایسه شد. در آزمایش سوم، اثر سطح فشار اسمزی (250، 300 و 350 میلی اسمول در لیتر) و سطح گلیسرول (پنج و هفت درصد) در رقیق کننده بر پایه سه درصد نانو ذرات لسیتین سویا و در آزمایش چهارم، اثر جایگزینی گلیسرول با اتیلن گلیکول ارزیابی شد. هدف از آزمایش پنجم، مطالعه اثر سطوح مختلف ترهالوز (صفر، 3/12، 6/25، 12/5، 25 و 50 میلی مول در میلی لیتر) در رقیق کننده بر پایه سه درصد نانو ذرات لسیتین سویا بود. در آزمایش ششم، اثر برهمکنش سطوح مختلف آنتی اکسیدان های ویتامین E (صفر، 0/1، 0/2، 0/4، 0/6و یک میلی مول) و گلوتاتیون (صفر، 0/5، یک، دو و سه میلی مول) و زمان های تعادل مختلف (چهار و 24 ساعت) بر کیفیت اسپرم ارزیابی شد. در آزمایش هفتم، آزمون های تکمیلی روی بهترین تیمار آزمایش ششم انجام گرفت. ویژگی های حرکتی اسپرم با کمک سامانه CASA، ریخت شناسی اسپرم با محلول هانکوک، یکپارچگی غشای اسپرم با آزمایش هاس (HOS)، وضعیت آپوپتوزیس (رنگ آمیزی آنکسین)، فعالیت میتوکندریایی (رنگ آمیزی رودامین-123)، یکپارچگی آکروزومی (رنگ آمیزی PSA) و نرخ باروری در شرایط آزمایشگاهی بررسی شد. داده ها با آزمون شاپیرو برای تست توزیع نرمال بودن، بررسی شدند. سپس به روش GLM با نرم افزار SAS 9.1 تجزیه و تحلیل شدند. در آزمایش اول، رقیق کننده حاوی سه درصد نانو ذره لسیتین از لحاظ فراسنجه های جنبایی و فعالیت میتوکندریایی اسپرم ها و یکپارچگی غشاء بهتر از رقیق کننده تجاری برای انجماد اسپرم گاو عمل کرد. در آزمایش دوم، فراسنجه های جنبایی پیش رونده، LIN و STR اسپرم گاو در رقیق کننده بر پایه نانو ذره لسیتین نسبت به رقیق کننده بر پایه نانو لیپوزوم لسیتین، بهتر بودند (0/05P<). نتایج آزمایش سوم نشان داد که رقیق کننده های حاوی هفت درصد گلیسرول و با فشار اسمزی 300 یا 250 میلی اسمول نسبت به سایر تیمارها دارای عملکرد محافظ انجمادی بهتری بودند. جایگزینی گلیسرول با اتیلن گلیکول در رقیق کننده بر پایه نانو ذره لسیتین سویا در آزمایش چهارم، اثر مفیدی بر انجماد پذیری اسپرم پس از فرآیند انجماد یخ گشایی نداشت. اضافه کردن ترهالوز به رقیق کننده در ازمایش پنجم در بهبود فراسنجه های تحرک، زنده مانی، یکپارچگی غشای سلول و درصد اسپرم هنجار، اثر معنی داری نداشت. نتایج آزمایش ششم نشان داد که فراسنجه های حرکتی اسپرم در زمان تعادل چهار ساعته، نسبت به زمان تعادل 24 ساعته، بهتر بود و استفاده از آنتی اکسیدان های ویتامین E و گلوتاتیون، فراسنجه های حرکتی اسپرم پس از انجماد را بهبود نداد. نتایج آزمون های تکمیلی نشان داد که تیمار حاوی یک میلی مول گلوتاتیون، اگرچه از نظر نرخ تشکیل بلاستوسیست در شرایط آزمایشگاهی نسبت به گروه شاهد، کمتر بود، اما از لحاظ درصد اسپرم با غشای فعال و درصد اسپرم های زنده نسبت به سایر تیمارها، بهتر بود (0/05P<). در مجموع، در این رساله بهترین ترکیب رقیق کننده که برای انجماد اسپرم گاو هلشتاین به دست آمد شامل سه گرم نانو ذره لسیتین سویا و هفت درصد گلیسرول در 100 میلی لیتر بافر تریس با فشار اسمزی 300 میلی اسمول بود.
- Abstract
- The advantages of soybean lecithin-based extenders have been reported by several studies in human, Bovine, Equine, Ovine, Canine and Caprine. Lecithin-based extenders for cattle were produced commercially, but there is not available information about their composition. The objective of the present study was define a soy lecithin nanoparticles-based extender for cryopreservation of Holstein bull sperm. Semen samples were collected from six bulls by artificial vagina twice a week (6 ejaculates/bull). This study was carried out in six experiments: In the first experiment, the effect of restructuring lecithin to nanoparticles and various levels of lecithin (1, 2, 3 and 4 % w/v) on sperm quality after cryopreservation was studied. In the second experiment, extender made using the lecithin nanoparticles was compared with lecithin nanoliposome-based extender and commercial lecithin-based extender. In the third experiment, the effect of the osmolarity (250, 300 and 350 mOsm/L) and glycerol levels (5 and 7 %) in lecithin nanoparticles-based extender were studied. In the fourth experiment, the effect of replacing the glycerol with ethylene glycol in lecithin nanoparticles-based extender was studied. The objective in the fifth experiment was to assess the effect of of trehalose (0, 3.12, 6.26, 12.5, 25 and 50 mMol/ml) in extender on post-thaw bull sperm quality. In the sixth experiment, the effect of the interaction between different levels of vitamin E (VE: 0.1, 0.2, 0.4, 0.6 and 1 mM) and Glutathione (Glu: 0.5, 1, 2 and 3 mMol/ml) in extender and equilibrium different time (4 and 24 h) was assessed. Some parameters including sperm motility (CASA), plasma membrane functionality (HOST), apoptotic status (Annexin staining), mitochondria activity (Rhodamine-123 staining), acrosome integrity (PSA staining) and in vitro fertility rate were evaluated. All data were checked in normal distribution by Proc Univariate and Shapiro–Wilk test. Then, data were analyzed by GLM procedure using SAS 9.1. The first experiment results showed that extender containing 3% lecithin nanoparticles, in terms of the parameters of motility, sperm membrane integrity and mitochondrial activity was better than the commercial extender after cryopreservation. In the second experiment, progressive motility, LIN and STR for lecithin nanoliposome-based extender was less than lecithin nanoparticles-based extender and commercial extender. In the third experiment the extender contain of 7 % of glycerol with osmalarity of 300 and 250 mOsm/L had better cryprotective operation on bull sperm. Replacing glycerol with ethylene glycol in lecithin nanoparticles-based extender did not have a positive effect on sperm quality after freezing-thawing process. Also, adding trehalose to extender, did not improve post-thaw bull sperm quality. In the sixth experiment, in terms of sperm motility parameters, the treatment with four hours equilibrium time was better than the treatment with twenty four hours equilibrium time and usage of antioxidants could not improve them. But treatment containing 1 mMol/ml glutathione was better than other treatments in terms of the percentage of live sperm and sperm with active plasma membrane, although blastocysts rate in IVF was less in Glu-1 compared with control group. In general, the best combination that had better for bull sperm cryprotectione was 3% soy lecithin nanoparticles and 7% glycerol in 100 ml of Tris buffer with 300 mOsmol osmotic pressure. Key Words: Bovine, Semen, Freezing, Diluents
