عنوان پایان‌نامه
بررسی اثرات والپرونیک اسید بر کروماتین وتغییرات اپی ژنتیک در سلول های غیر چسبنده مغز استخوان موش در حضور وعدم حضور فاکتور رشد
- رشته تحصیلی
- بیوشیمی
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک شماره ثبت: 11562ب;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 79110;کتابخانه مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک شماره ثبت: 11562ب;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 79110
- تاریخ دفاع
- ۱۵ اسفند ۱۳۹۵
- دانشجو
- جواد سرگل زایی
- استاد راهنما
- عذرا ربانی چادگانی
- چکیده
- داروهای ضد سرطان از مکانیسم های سلولی مختلفی در درمان سلولهای سرطانی استفاده می نمایند . والپروئیک اسید (2-پروپیل پنتانوئیک اسید ، VPA) یک مهار کننده هیستون داستیلاز می باشد که بطور وسیع در درمان صرع و اختلال دوقطبی وانواع سرطان ها استفاده می شود. این دارو اثر خود را با هیپراستیلاسیون پروتئین های هیستونی اعمال می نماید. داروهای ضد تومور علاوه بر تاثیر گذاری بر سلولهای بدخیم ,اکثرا موجب اثرات جانبی بر سلولهای طبیعی نیز میشوند. یکی از بافت هایی که در این راستا در استفاده از والپروئیک اسید متاثر می شود سلولهای مغز استخوان است که تولید کننده سلولهای قرمز و سفید خون می باشند . اگرچه امروزه توجه زیادی به اثر داروهای ضد توموری بر روی مغز استخوان معطوف شده است و لیکن اطلاعات اندکی در مورد تأثیر داروی والپروئیک اسید بر روی این سلولها وجود دارد. در این مطالعه سعی شده است که اثر این دارو بر روی سلول های غیر چسبنده مغز استخوان در حضور و عدم حضور فاکتور رشد (CSF) از جنبه های مختلف مورد بررسی قرار گیرد. ضمنا از آنجایی که هسته سلول مورد حمله این دارو می باشد در واقع کروماتین و ترکیبات آن میتوانند بعنوان هدفی برای دارو باشند. به همین دلیل در این مطالعه به منظور بدست آوردن اطلاعاتی در مورد میانکنش این دارو با ترکیبات کروماتین، به بررسی اثر والپروئیک اسید برکروماتین , DNA و هیستون H1 پرداخته شد. نتایج نشان داد که والپروئیک اسید باعث کاهش میزان بقاء سلولهای غیر چسبنده مغز استخوان در رفتاری وابسته به زمان و غلظت میشود. میزان پروتئین هیستونی H1 و غیر هیستونی HMGB1 بعد از تیمار روند کاهشی وابسته به غلظت نشان می‌دهند. کاهش HMGB1 در اثر رهاسازی این پروتئین به خارج سلول است بطوریکه در محیط کشت رویی سلولهای تیمارشده افزایش شدید این پروتئین را نشان میدهد. از طرفی بیان HMGB1 نیز در حضور VPA کاهش قابل ملاحظه ای را نشان میدهد . رنگ آمیزی سلولها با آکریدین اورنج/اتیدیوم بروماید و تعیین درصد سلولهای آپوپتوز و نکروز در فلو سایتومتری ، بیانگر تغییرات مورفولوژیک از جمله قطعه قطعه شدن کروماتین در سلول های تیمار شده با این دارو می‌باشد که می تواند بیانگر آپوپتوز و نکروز در سلولهای غیر چسبنده مغز استخوان باشد. با افزایش غلظت دارو چرخه سلولی در مرحله G0/G1 متوقف میشود. شکسته شدن آنزیم PARP , به‌عنوان یکی از مارکر های آپوپتوز سلولی , در سلولهای مغز استخوان با افزایش غلظت VPA افزایش می یابد. درواقع این نتیجه بیانگر آن است که دارو موجب القای آپوپتوز در سلولها و درنتیجه فعال شدن کاسپازهای 3 و7 به‌خصوص در غلظت‌های بالاتر می‌گردد. بیان ژن Csapase 3 بریده شده با افزایش غلظت VPA نیز افزایش شدید را نشان میدهد که تاکید کننده آغاز آپوپتوز و همچنین شکسته شدن PARP برای شروع آپوپتوز در سلولهای غیرچسبنده مغز استخوان می باشد. در این سلولها با افزایش غلظت VPA میزان استیلاسیون لیزین شماره 9 هیستون H3 نیز افزایش می‌یابد. این مشاهده نشان می‌دهدکه داروی والپروئیک اسید می‌تواند با اثر بر اپی ژنتیک این سلولها اثراتی بر تنظیم رونویسی ژنها داشته باشد . کلنی زایی سلولهای مغز استخوان در حضور فاکتورهای رشد CSF در محیط نیمه جامد آگار و در حضور داروی فوق کاهش می‌یابد. از سوی دیگر میزان پروتئین‌های غیر هیستونی HMGB1 در حضور CSF کاهش و رهاسازی آن افزایش می یابد . میانکنش VPA با کروماتین و هیستون H1 نشان میدهد که میانکنش سبب تغییر در میزان جذب کروماتین در رفتاری وابسته به غلظت میشود. فلورسانس ذاتی کروماتین در حضور داروی والپروئیک اسید کاهش می‌یابد. تغییر ساختار دوم کروماتین و کاهش میزان بیضی‌واری مولی طیف CD کروماتین در ناحیه منفی 225- 220 در حضور این دارو مشاهده میشود. پروتئین H1 نیز با افزایش غلظت VPA باعث کاهش نشر در طول‌موج 305 نانومتر(مربوط به اسیدآمینه تیروزین) میشود. همچنین این دارو تمایل بیشتری به هیستونی H1 در مقایسه با DNA و کروماتین را نشان میدهد. همچنین محاسبه مقدار Ka و n از روش دیالیز تعادلی ، تمایل قابل توجه VPA به هیستون H1 را نشان می دهد. مقادیر منفی تغییرات انرژی آزاد اتصال دارو به کروماتین و H1 بیانگر خودبخودی بودن واکنش می باشد. با توجه به نتایج فوق می‌توان پیشنهاد نمود که کروماتین و اجزای پروتئینی آن مخصوصا هیستون H1 می تواند به عنوان یکی ازجایگاه‌های اثر VPA باشد . که از طریق آن، باعث تغییرات زیادی در ساختار عملکرد کروماتین شده و به این طریق فرآیندهای مهم کروماتین مانند رونویسی و همانندسازی را مورد تاثیر قرار میدهد. از سوی دیگر همچنین با توجه به اثرات مخرب این دارو بر سلول های مغز استخوان و ایجاد آپوپتوز در این سلول ها, در استفاده این دارو می بایست توجه زیادی نمود.
- Abstract
- The anticancer drugs widely prescribed for cancer treatment. The effect of Hyperacetylation the histone proteins. Valproic acid (2-propyl pentanoic acid, VPA) is the histone deacetylase (HDAC) inhibitor used for the treatment of epilepsy and bipolar disorder. Given that bone marrow is one of the main sites of VPA drug cytotoxicity and treatment with these drugs causes bone marrow suppression and anemia in patients, the effect of the VPA on viability and induction of apoptosis on non-adherent mouse bone marrow stem cells was investigated. in the present study we have investigated the effect of this drug on non-adherent bone marrow cells was studied to explore the ability of colony formation. effects of VPA treatment on cytotoxicity investigated in non-adhesive bone marrow cells in the presence and the absence of CSF. in addition, since the drug is attacking the cell nucleus chromatin and its compounds can have as a target for drugs. Also, we have investigated the interaction of VPA on chromatin components and H1 proteins. The results obtained from the effect of VPA on non-adherent bone marrow cells showed that viability was decreased in a dose dependent manner. Pattern of histone proteins and non-histone protein HMGB1 extracted from these cells decreased as drug concentration increased. HMGB1 release under exposure to VPA From the results, And the expression of HMGB1 in the presence of VPA is significantly reduced. Acridine orange/ ethidium bromide and Hoechst 33258 staining of the treated cells revealed morphological changes such as chromatin condensation in hematopoietic bone marrow cells indicating of apoptosis and necrosis. To determine the mechanism of VPA-induced cell death, cell cycle analysis using PI staining, PARP and flow cytometry was used. Apoptosis on non-adherent mouse bone marrow stem cells was caspase-mediated as demonstrated by dose-dependent cleavage of PARP and caspase 3 following exposure to VPA. Immunoblot analysis of histone H3K9 acetylation indicated that VPA was increased acetylation of H3K9 in these cells. VPA reduced the number and differentiation status of bone marrow-derived precursors when cultured in the presence of colony stimulating factor (CSF). The cells treated with the drug exhibited cell shrinkage, DNA fragmentation, anion superoxide production. Also, in the present study we have investigated the interaction of VPA on chromatin components and H1 proteins. Interaction of VPA with chromatin and H1 alters UV absorbance of chromatin and H1 in a dose-dependent manner but absorbance of DNA in the presence of VPA decreased at 210 nm but remains unchanged at 260 nm. Secondary structure of chromatin, DNA and H1 is altered and molar ellipticity of CD spectrum was decreased. Moreover VPA showed higher affinity to histone H1 compared to chromatin and DNA. Fluorescence emission of chromatin and H1 was decreased upon increasing drugs concentrations but in DNA remains unchanged. The results showed that VPA quenched chromophores of chromatin and H1 a stronger than DNA. The binding of the drug exhibited hypochromicity in thermal denaturation profiles. The binding was positive cooperation with spontaneous reaction and Chromatin and H1 exhibited higher binding constant and number of binding sites than DNA upon binding to VPA. From the results showed above it is concluded that chromatin and its component can be considered as a new target for anticancer drugs such as VPA. These drug have pronounced toxicity on hematopoietic bone marrow stem cells in which may affect haematopoiesis. Therefore during prolonged usage of these drug, patients may counteract with problem like anemia and leukemia. Understanding the mechanisms of this drug can be provide insights to design drugs with better performance and more effective combination therapies.
