عنوان پایان‌نامه

بررسی مکانیسم عمل ومیانکنش داروی ایرینوتکان باپروتئین HMGB۱در سطح سلولهای سرطانی سینه MCF-۷ ودر محلول



    دانشجو در تاریخ ۲۶ دی ۱۳۹۵ ، به راهنمایی ، پایان نامه با عنوان "بررسی مکانیسم عمل ومیانکنش داروی ایرینوتکان باپروتئین HMGB۱در سطح سلولهای سرطانی سینه MCF-۷ ودر محلول" را دفاع نموده است.


    رشته تحصیلی
    بیوشیمی
    مقطع تحصیلی
    دکتری تخصصی PhD
    محل دفاع
    کتابخانه مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک شماره ثبت: 11568ب;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 79679;کتابخانه مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک شماره ثبت: 11568ب;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 79679
    تاریخ دفاع
    ۲۶ دی ۱۳۹۵
    دانشجو
    سعیده کیوانی قمصری
    استاد راهنما
    عذرا ربانی چادگانی
    چکیده
    لینک فایل چکیده
    دارو‌ی ایرینوتکان از قویترین داروهای ضد توموری می‌باشد که برای درمان طیف وسیعی از سرطان ها تجویز می‌شود. هدف اصلی شناخته شده داروی ایرینوتکان، آنزیم توپوایزومراز I است. دارو از طریق اتصال به کمپلکس DNA - توپوایزومراز I سبب پایدار شدن این کمپلکس دوتایی شده و با ایجاد شکست در ساختار DNA از همانندسازی و رونویسی آن ممانعت می‌کند. از آن‌جایی که در هسته سلول یوکاریوتی، DNA غالباً به صورت ترکیب نوکلئوپروتئینی به نام کروماتین حضور دارد و تحقیقات نشان داده اند کروماتین یکی از اهداف اصلی این دارو بعد از ورود به درون سلول می‌باشد. در کار حاضر به بررسی اثر ایرینوتکان بر پروتئین HMGB1 که مهم ترین گروه پروتئین های غیر هیستونی می باشند پرداخته شده است. پروتئین HMGB1 در تنظیم فعالیت های مختلفی نظیر رونویسی، همانندسازی، نوترکیبی و ترمیم DNA مشارکت می نماید. انتقال این پروتئین از هسته به سیتوپلاسم و در نهایت به خارج از سلول در سلولهای توموری گزارش شده است. در این مطالعه میانکنش دارو با پروتئین HMGB1 به صورت آزاد در محلول و اثر آن در ایجاد آپوپتوز در سلول های سرطانی سینه MCF-7 مورد بررسی قرار گرفته است. داروی ایرینوتکان سبب کاهش میزان بقاء سلول‌های سرطان سینه MCF-7 در رفتاری وابسته به زمان و غلظت می‌شوند. افزایش غلظت های مختلف ایرینوتکان موجب افزایش بیان پروتئین HMGB1 می شود در حالیکه میزان بیان پروتئین MMP-9 کاهش می یابد. الگوی الکتروفورزی پروتئین HMGB1 نشان داد که ایرینوتکان به صورت وابسته به غلظت موجب کاهش میزان این پروتئین بر روی ژل SDS- پلی اکریل آمید می گردد. همچنین نتایج حاصل از بررسی تاثیر دارو بر رها شدن HMGB1 از سلول ها نشان داد که در حضور ایرینوتکان رهاسازی این پروتئین ها به خارج از سلول ها صورت نمی گیرد. به نظر می‌رسد اتصال دارو به ترکیبات کروماتین و HMGB موجب فشرده شدن کروماتین شده و به واسطه آن استخراج پروتئین HMGB1 بوسیله روش های معمولی امکان پذیر نمی باشد. اثر دارو بر تغییرات اپی ژنتیکی H3K9Ac نشان داد که افزایش غلظت دارو موجب کاهش میزان استیلاسیون H3K9 می شود. در مرحله بعد، ایجاد آپوپتوز در سلول های MCF-7 در حضور و عدم حضور غلظت های مختلف ایرینوتکان مورد مطالعه قرار گرفت. رنگ آمیزی سلول‌ها با آکریدین اورنج/اتیدیوم بروماید و هوخست 3325 نشان داد، افزایش غلظت ایرینوتکان موجب ایجاد تغییرات مورفولوژیک از جمله قطعه قطعه شدن هسته و فشردگی کروماتین در سلول ها می شود که بیانگر آپوپتوز و درصد ناچیزی نکروز در سلول‌ها باشد. نتایج حاصل از فلوسایتومتری وقوع آپوپتوز اولیه را در سلول های تیمار شده با دارو تایید نمود. بررسی قطعه قطعه شدن DNA با استفاده از ژل آگارز و روش دی فنیل آمین حاکی از آن است که ایرینوتکان به صورت وابسته به غلظت موجب افزایش قطعه قطعه شدن DNA می گردد. اندازه گیری تولید آنیون سوپراکسید با استفاده از روش احیای سیتوکروم c نیز نشان دهنده تولید این آنیون در حضور ایرینوتکان بود. بررسی شکسته شدن آنزیم PARP نیز نشان داد که با افزایش غلظت دارو، قطعه 89 کیلودالتونی PARP ظاهر می شود که میزان آن با بالا رفتن غلظت دارو افزایش می یابد. در نهایت رنگ آمیزی سلول ها با رنگ PI بیان کننده ایجاد مرگ سلولی توسط دارو در فاز S سلولی می شود. نتایج اسپکتروسکوپی جذبی حاصل از میانکنش ایرینوتکان با پروتئین HMGB1 آزاد در محلول نشان می دهد میزان جذب پروتئین در اثر میانکنش با دارو در طول موج های 220 و 280 نانومتر کاهش می یابد که این میزان کاهش در 220 نانومتر بیشتر می باشد. طیف نشری HMGB1 نیز در یک روند وابسته به غلظت دارو کاهش می یابد که نشان دهنده خاموشی شدید کروموفورهای موجود در پروتئین است. بررسی غیر طبیعی شدن حرارتی HMGB1 نشان می دهد که غلظت های پایین دارو موجب ایجاد هایپرکرومیسیتی و غلظت های بالا هیپوکرومیسیتی مشخصی را در ساختار پروتئین ایجاد می نماید. علاوه بر این مطالعات CD نشان داده است که دارو به پروتئین متصل شده و سبب تغییر ساختار دوم پروتئین می گردد. نتایج به دست آمده از دیالیز تعادلی حاکی از آن است که فرآیند اتصال ایرینوتکان به HMGB1 به صورت تعاونی مثبت و با ثابت اتصالی معادل M-1 102×95/3 است. مطالعه حاضر اثرات آپوپتوزی ایرینوتکان را در سلول های MCF-7، پروتئینHMGB1 در این سلول ها و به صورت آزاد در محلول نشان می دهد و چشم انداز جدیدی بر مکانیسم اثر این دارو ایجاد می نماید. با توجه به نتایج فوق می‌توان پیشنهاد کرد که دارو ساختار کروماتین را فشرده نموده و مانع از استخراج پروتئین HMGB1 از سلول ها می شود. بعلاوه, با توجه به اهمیت تغییرات ویژه در وضعیت مدیفیکاسیون پروتئین های هیستونی کروماتین نتایج ما حاکی از کاهش استیلاسیون لیزین شماره 9 درهیستون H3 توسط دارو است که فشردگی حاصل شده در ساختار کروماتین از نشانه های سلول های آپوپتوتیک است. نتایج رنگ آمیزی سلول ها و فلوسایتومتری نیز نشان دهنده القای آپوپتوز اولیه در سلول ها می باشند. به صورتیکه دارو موجب القای مرگ سلولی در فاز S می شود. همچنین میانکنش ایرینوتکان با پروتئین HMGB1 آزاد در محلول، تمایل بالا، ثابت اتصال دارو به پروتئین و تغییرات ساختاری اعمال شده بر پروتئین HMGB1 حاکی از آن است که پروتئین HMGB1 نیز می تواند به عنوان هدف دارویی جدیدی جهت اتصال داروی ایرینوتکان در داخل هسته سلول مورد توجه قرار گیرد شناخت مکانیسم داروی فوق می تواند به طراحی داروهایی با کارایی بهتر و درمان های ترکیبی موثرتر کمک نماید.
    Abstract
    Irinotecan is a potent chemotherapy agent that is widely used in cancer therapy. It exerts its biological action through binding to DNA-Topo-I complex therefore induces break in DNA structure and inhibits transcription and replication. DNA is not naked in the nucleus and forms a chromatin complex in association with histone and non-histone proteins. HMGB1 protein is the most important non histone protein in chromatin structure. This protein participates in processes such as replication, transcription, recombination and DNA repair. Translocation of HMGB1 from nucleus to cytoplasm and extracellular space is also occurred in tumor cells. In the present study, we have investigated the mechanism of action and interaction of irinotecan with HMGB1 protein in MCF-7 cells and in solution and apoptotic effect of this drug on these cells. The results showed that irinotecan decreased viability of MCF-7 cells in a dose- and time- dependent manner. HMGB1expression in the drug-exposed cells compared to the control up-regulated however MMP-9 expression down-regulated. The content of non-histone protein HMGB1 decreased as drug concentration increased but HMGB1 release was not detected in these cells. It is concluded that irinotecan condenses chromatin and HMGB1 protein can not be extracted by manual procedures. H3K9Ac modification was reduced in a dose dependent manner in the cells. At the next step, apoptosis was studied in MCF-7 cells incubated with different concentrations of irinotecan. Acridine orange/ ethidium bromide and Hoechst 33258 staining of the treated cells revealed morphological changes such as chromatin condensation and nuclear fragmentation indicating occurence of apoptosis. Flow cytometry analysis confirmed early apoptosis in these cells. DNA fragmentation by agarose gel and diphenylamine method showed that irinotecan induces DNA fragmentation in a dose dependent manner. The cells exposed to various concentrations of irinotecan represent a significant increase in the anion supeoxide production and cytochrome c reduction. The cleavage of PARP demonstrated the level of 89 KD fragment of PARP is increased significantly upon raising irinotecan concentration. PI staining showed the drug inhibits DNA synthesis and in the presence of irinotecan the cells are arrested in S phase. UV/Vis spectroscopy results obtained from the interaction of irinotecan with HMGB1 protein free in solution shows hypochromicity in the absorbance at 220 and 280 nm. Intrinsic fluorescence emission intensity of protein was decreased in the presence of irinotecan. Thermal denaturation analysis demonstrated that the binding of the drug to HMGB1 induced hyperchromicity at low concentrations and hypochromicity at higher concentrations. Circular dichroism revealed that the drug binds with high affinity to HMGB1 and changes secondary structure of the protein. The results obtained from equilibrium dialysis showed that the binding of irinotecan to HMGB1 is positive cooperative with Ka= 3/95× 102 M-1. In general, the results obtained from this study indicate the apoptotic effects of irinotecan in MCF-7 cells, HMGB1 protein in these cells and HMGB1 free in solution. The results suggested that the drug can be compressed the chromatin structure and prevents HMGB1 protein extraction from cells. Histone proteins modification represents a reduction of acetylation H3 lysine 9 by drug that chromatin compaction is a sign of apoptotic cells. The results of cells staining and flow cytometry also showed induction of early apoptosis in the cells that induces cell death in S phase. The interaction of irinotecan with HMGB1 protein free in solution, its binding affinity, association constant of the drug to protein and structural changes on HMGB1 protein suggests that HMGB1 protein can be considered as a new target for irinotecan in the cell nucleus. Understanding the mechanisms of this drug can be provide insights to design drugs with better performance and more effective combination therapies. Irinotecan is a potent chemotherapy agent that is widely used in cancer therapy. It exerts its biological action through binding to DNA-Topo-I complex therefore induces break in DNA structure and inhibits transcription and replication. DNA is not naked in the nucleus and forms a chromatin complex in association with histone and non-histone proteins. HMGB1 protein is the most important non histone protein in chromatin structure. This protein participates in processes such as replication, transcription, recombination and DNA repair. Translocation of HMGB1 from nucleus to cytoplasm and extracellular space is also occurred in tumor cells. In the present study, we have investigated the mechanism of action and interaction of irinotecan with HMGB1 protein in MCF-7 cells and in solution and apoptotic effect of this drug on these cells. The results showed that irinotecan decreased viability of MCF-7 cells in a dose- and time- dependent manner. HMGB1expression in the drug-exposed cells compared to the control up-regulated however MMP-9 expression down-regulated. The content of non-histone protein HMGB1 decreased as drug concentration increased but HMGB1 release was not detected in these cells. It is concluded that irinotecan condenses chromatin and HMGB1 protein can not be extracted by manual procedures. H3K9Ac modification was reduced in a dose dependent manner in the cells. At the next step, apoptosis was studied in MCF-7 cells incubated with different concentrations of irinotecan. Acridine orange/ ethidium bromide and Hoechst 33258 staining of the treated cells revealed morphological changes such as chromatin condensation and nuclear fragmentation indicating occurence of apoptosis. Flow cytometry analysis confirmed early apoptosis in these cells. DNA fragmentation by agarose gel and diphenylamine method showed that irinotecan induces DNA fragmentation in a dose dependent manner. The cells exposed to various concentrations of irinotecan represent a significant increase in the anion supeoxide production and cytochrome c reduction. The cleavage of PARP demonstrated the level of 89 KD fragment of PARP is increased significantly upon raising irinotecan concentration. PI staining showed the drug inhibits DNA synthesis and in the presence of irinotecan the cells are arrested in S phase. UV/Vis spectroscopy results obtained from the interaction of irinotecan with HMGB1 protein free in solution shows hypochromicity in the absorbance at 220 and 280 nm. Intrinsic fluorescence emission intensity of protein was decreased in the presence of irinotecan. Thermal denaturation analysis demonstrated that the binding of the drug to HMGB1 induced hyperchromicity at low concentrations and hypochromicity at higher concentrations. Circular dichroism revealed that the drug binds with high affinity to HMGB1 and changes secondary structure of the protein. The results obtained from equilibrium dialysis showed that the binding of irinotecan to HMGB1 is positive cooperative with Ka= 3/95× 102 M-1. In general, the results obtained from this study indicate the apoptotic effects of irinotecan in MCF-7 cells, HMGB1 protein in these cells and HMGB1 free in solution. The results suggested that the drug can be compressed the chromatin structure and prevents HMGB1 protein extraction from cells. Histone proteins modification represents a reduction of acetylation H3 lysine 9 by drug that chromatin compaction is a sign of apoptotic cells. The results of cells staining and flow cytometry also showed induction of early apoptosis in the cells that induces cell death in S phase. The interaction of irinotecan with HMGB1 protein free in solution, its binding affinity, association constant of the drug to protein and structural changes on HMGB1 protein suggests that HMGB1 protein can be considered as a new target for irinotecan in the cell nucleus. Understanding the mechanisms of this drug can be provide insights to design drugs with better performance and more effective combination therapies.