عنوان پایان‌نامه
تاثیر باکتری های بازدارنده سیستم حدنصاب احساس بر بیماریزایی Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum روی سیب زمینی.
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی شماره ثبت: 7076;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 76714;کتابخانه مرکزی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی شماره ثبت: 7076;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 76714
- تاریخ دفاع
- ۲۷ شهریور ۱۳۹۵
- دانشجو
- عادله سبحانی پور
- استاد راهنما
- کیوان بهبودی
- چکیده
- حدنصاب احساس (QS) مکانیسم ارتباط سلولی همراه با تولید مولکول های کوچک پیام رسان مانند اسیل هموسرین لاکتون (AHL) در جمعیت باکتری هاست. بسیاری از باکتری های گرم منفی از سیستم QS مبتنی بر سیگنال های AHL برای تنظیم تو لید فاکتورهای بیماریزایی بهره می جویند و هرگونه اختلال در این سیستم منتهی به توقف تولید این فاکتورها می گردد. از این رو پدیده خاموش کردن سیستمQS به عنوان راه حلی امیدوارکننده در کنترل بیولوژیک برخی بیماری های باکتریایی در نظر گرفته می شود. پوسیدگی نرم باکتریایی که توسط Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum ایجاد می شود یک بیماری جدی روی سیب زمینی در تمام دنیاست. این باکتری بیان فاکتورهای کلیدی بیماریزایی خود را توسط AHL و سیستم QS تنظیم می کند. در پژوهش حاضر، امکان ایجاد اختلال در فرایندهای تحت تنظیم سیستم QS این بیمارگر با استفاده از تجزیه زیستی سیگنال های C6-HSL و C8-HSL به وسیله جدایه های باکتریایی مورد بررسی قرار گرفت. در بخش اول این تحقیق ، 1280 جدایه باکتری از ریزوسفر گیاهان مختلف میزبان این بیمارگر از مناطق مختلف ایران جداسازی شد. برای غربال آن ها از جهت توان غیرفعال سازی AHLs از Chromobacterium violaceum CV026 و Escherchia coli pSB401 به عنوان گزارشگر استفاده شد. 69 جدایه به میزان بسیار زیاد قادر به تجزیه AHL بودند. در بررسی های کمی با استفاده از استخراج و اندازه گیری آنتی بیوتیک وایولاسئین و سنجش نورافشانی حاصل از استرین های گزارشگر تمام جدایه ها تفاوت چشمگیر با شاهد نشان دادند. همه این جدایه ها قادر به تجزیه AHL طبیعی تولید شده توسط P. carotovorum نیز بودند. تاثیر ریزوباکتری های تجزیه کننده AHL بر تغییر فعالیت و کارایی LuxI/LuxR با استفاده از سیستم انتشار دو خطی در آگار مورد ارزیابی قرار گرفت. هر دو خاصیت ممانعت از فعالیت LuxI و LuxR در برخی از جدایه ها مشاهده شد. برای بررسی دخالت در تنظیم ژنی وابسته به AHL در P. carotovorum، تولید آنزیم پروتئاز با مشاهده وجود هاله شفاف اطراف این پاتوژن روی محیط کشتSMA مشخص شد. برخی جدایه ها تا حد زیادی تولید پروتئاز را کاهش دادند. در بخش دوم این تحقیق توانایی جدایه ها در کاهش بیماری زایی پکتوباکتریوم روی سیب زمینی بررسی شد. جدایه های انتخابی در بررسی توان خاموش کنندگی کوروم سنسینگ، به طرز چشمگیری لهیدگی غده سیب زمینی ناشی از این پاتوژن را کاهش دادند. 41 جدایه توانستند بیش از 50 درصد کاهش در لهیدگی غده ایجاد کنند. به منظور یافتن لاکتونازها و آسیلازها، استخراج دی ان ایِ از این جدایه ها انجام و با آزمون PCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن های لاکتونازی aiiA و qsdA و آسیلازی hacB ردیابی شدند. قطعات قابل انتظار تکثیرشده در آزمون PCR از این جدایه ها توالی یابی شدند. مقایسه توالی های نوکلئوتیدی با استفاده از نرم افزار بلاست با سایر توالی های متناظر آن ها در بانک جهانی ترادف ها (ژن بانک) انجام شد. نتایج نشان داد که ژن aiiA در 27 جدایه گرم مثبت و شش جدایه گرم منفی از جمله Acinetobacter calcoaceticus 32P و Enterobacter sp. 31P و Chryseobacterium lathyri 19K وجود داشت. ژن qsdA و ژن hacB در هیچ یک از جدایه ها ردیابی نشد. نتایج روش HPLC نشان داد که در برخی جدایه ها هیچ مقداری از AHL ردیابی نشد که نشانگر تجزیه کامل آن توسط آنتاگونیست ها و توانایی بالای تجزیه کنندگی این آنزیم ها بود. در بین جدایه ها، 16 جدایه برتر بر اساس تست های بیوشیمیایی و بررسی توالی 16srDNA بیش از 98 درصد شباهت به Bacillus toyoensis (استرین های A9، L2، W11 و F20)، B. anthracis (استرین های F21 و C18)، B. endophyticus (استرین B3)، B. simplex (استرین H231)، Chryseobacterium lathyri (استرین K19)، Acinetobacter calcoaceticus (استرین P32)، Enterobacter xiangfangensis (استرین N7)، Escherichia coli (استرین M1)، Caulobacter vibrioides (استرین H121) و Brevundimonas bullata (استرین های H33 و H19) نشان دادند. این جدایه ها برای کاهش پوسیدگی ساقه نیز آزمایش شدند که جدایه های Bacillus toyoensis 2L، Escherchia coli 1M و Acinetobacter calcoaceticus 32P بیش از 70 درصد پوسیدگی ساقه را کاهش دادند.
- Abstract
- Quorum sensing (QS) is the bacterial cell-to-cell communication with production of small signal molecules such as acyl-homoserine lactones (AHL). Many Gram negative bacteria use AHLs mediated QS to produce virulence factors and any interference in this system could be resut inhibition of virulence factors. Therefore quorum quenching is a novel and hopefull way in biological control of plant bacterial diseases. Bacterial soft rot caused by Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum is a serious disease of potato in the world. The primary virulence mechanism of this pathogen is the excretion of pectolytic enzymes that macerate host tissues causing the typical soft-rot symptoms. This bacterium autoregulate expression of key virulence factors by means of AHL and QS system. In present survey, the possibility of interfering with the QS-regulated phenomenon in this pathogen via biodegrading of C6-HSL and C8-HSL by bacterial isolates. At the first part of this survey, 1280 bacterial strains were isolated from potato rhizosphere in Iran. For the screening of isolates for AHL-inactivating, Chromobacterium violaceum CV026 and Escherchia coli pSB401 was used as biosensors. The 69 isolates have highly AHL-degrading potential. Based on quantification assay of AHL residual using extraction of violacein and bioluminesance measurement of reporter strains, all isolates showed significant difference with control. All these isolates were capable to degraded natural N-AHL produced by P. carotovorum. The effect of the 66 AHL-degrading rhizobacteria (quencher) on modulation of LuxI/LuxR activity and inhibition of AHL synthesis was determined using an agar diffusion double streak assay system. Both LuxI and LuxR modulation was observed in some of the quencheres .Bioassay for interference of AHL-depent gene regulation in P. carotovorum performed on SMA medium and the protease production by this pathogene was evaluated by the presence of a clear zone in the agar. Some isolates reduced significantly the protease production. In the second part of present study, the ability of isolates on reduction of pectobacterium virulence on potato was investigated. In quenching experiments selected isolates were markedly reduced the pathogenicity of this pathogene in potato tubers. 41 strains reduced tuber soft rot more than 50 percent. For detecting lactonases and acylases, genomic DNA was extracted for each isolate and specific primer sets were used for amplification of aiiA & qsdA lactonase genes and hacB acylase gene. The amplified PCR products were sequenced. Comparison of nucleotide sequences with their cognate sequence were performed using the BLAST search in GenBank. The BLAST search exhibited the aiiA gene detected in 27 gram-positive and 6 gram-negative isolates, such as Acinetobacter calcoaceticus 32P and Enterobacter sp. 31P and Chryseobacterium lathyri 19K. The qsdA and hacB genes was not detecte in isolates. This enzyme change the relative conformational structure of the signaling molecule, which prevents binding to the LuxR transcriptional regulator. The AHL degradation measurement by HPLC showed that residue of C6-HSL was not detected in some isolates that means completely degradation of it by antagonists. Among isolates, 16 of the best had at least 98 percent similarity with Bacillus toyoensis (20F, 9A, 11W and 2L strains), B. anthracis (21F and 18C strains), B. endophyticus (3B strain), B. simplex (231H strain), Chryseobacterium lathyri (19K strain), Acinetobacter calcoaceticus (32P strain), Enterobacter xiangfangensis (7N strain), Escherichia coli (1M strain), Caulobacter vibrioides (121H strain) and Brevundimonas bullata (33H and 19H) using biochemical tests and 16SrDNA sequencing. These isolates were used for inhibition of stem tissue maceration. Bacillus toyoensis 2L, Escherchia coli 1M and Acinetobacter calcoaceticus 32P reduced stem maceration more than 70 percent. Key words: QS, Pectobacterium carotovorum, Acyl homoserin lacton, bacterial soft rot.
