عنوان پایان‌نامه
طراحی و ساخت نانوبیوسنسور الکتروشیمیایی تعیین کمی microRNAدخیل در تشخیص زود هنگام سرطان سینه
- رشته تحصیلی
- نانوبیوتکنولوژی
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه دانشکده علوم و فنون نوین شماره ثبت: 292411;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 72742;کتابخانه دانشکده علوم و فنون نوین شماره ثبت: 292411;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 72742
- تاریخ دفاع
- ۱۲ بهمن ۱۳۹۴
- دانشجو
- مصطفی عظیم زاده تفت
- استاد راهنما
- مهدی رهایی جهرمی
- چکیده
- در سال‌های اخیر microRNAهای گردشی موجود در خون، به‌عنوان بیومارکرهای جدید و معتبر جهت تشخیص زودهنگام بیماری‌ها ازجمله انواع سرطان مطرح شده‌اند. هدف از انجام این تحقیق، طراحی و ساخت یک سنسور دقیق جهت اندازه‌گیری miRNA در نمونه واقعی (پلاسما/سرم خون انسان)، بدون نیاز به دست ورزی نمونه بود. بدین منظور، دو سنسور (بیوسنسور و نانوبیوسنسور الکتروشیمیایی) برای اندازه‌گیری miR-155، به‌عنوان بیومارکر اختصاصی تشخیص زودهنگام سرطان پستان طراحی و ساخته شد. بیوسنسور الکتروشیمیایی بر پایه الکترود طلا و استفاده از پروب‌های تیول‌دار اختصاصی miR-155 و اوراست‌بلو به‌عنوان شناساگر الکتروشیمیایی طراحی گردید. نانوبیوسنسور الکتروشیمیایی بر اساس الکترود کربن شیشه‌ای اصلاح‌شده با گرافن‌اکسید و نانومیله‌ی طلا و به‌کارگیری پروب‌های تیول‌دار اختصاصی miR-155 و اوراست‌بلو ساخته شد. آنالیزهای تصویربرداری میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM)، اسپکتروفتومتری، تصویربرداری و آنالیز عنصری توسط میکروسکوپ الکترونی روبشی FE-SEM))، ولتامتری چرخه‌ای و طیف‌سنجی امپدانس الکتروشیمیایی، به‌منظور تأیید مراحل ساخت سنسورها انجام شدند. برای ارزیابی انتخاب‌گری سنسورها، از توالی کاملاً ناجور، توالی‌های با پلیمورفیسم یک باز و سه باز نسبت به miR-155 استفاده شد. از محیط سرم و پلاسمای خون انسان برای اثبات عملکرد سنسورها در نمونه‌های کلینیکی استفاده گردید. نتایج آزمون‌های فوق، مراحل مختلف ساخت سنسورها را تأیید نمودند. بیوسنسور الکتروشیمیایی قادر به شناسایی miR-155 با حد تشخیص pM 5/13 و محدوده‌ی خطیpM 0/50 تا nM 0/15 بود؛ درحالی‌که برای نانوبیوسنسور، حد تشخیص fM 6/0 و محدوده خطی fM 0/2 تا pM0/8 به دست آمد. در هر دو سنسور، انتخاب‌گری و اختصاصی بودن عمل بسیار بالا مشاهده شد به‌طوری‌که به‌وضوح قادر به تشخیص miRNA هدف از توالی‌های با پلیمورفیسم یک باز و سه باز و توالی کاملاً ناجور با مولکول هدف بودند. تکرارپذیری، پایداری و عملکرد سنسورها در محیط سرم/پلاسما، بسیار مناسب ارزیابی گردید. با مقایسه نتایج دو سنسور، استفاده از گرافن‌اکسید و نانومیله طلا در نانوبیوسنسور باعث افزایش حساسیت آن تا حدود 6 برابر نسبت به بیوسنسور گردید. درمجموع در این تحقیق بیوسنسور و نانوبیوسنسوری برای اولین بار بر مبنای نشانگر الکتروشیمیایی اوراست‌بلو ارائه گردید که حد تشخیص پایین و محدوده خطی گسترده را به‌طور هم‌زمان دارا می‌باشد و همچنین از حیث سادگی، زمان پاسخ و هزینه پایین، نسبت به اغلب کارهای پژوهشی پیشین برتری خود را به اثبات رساند. با توجه به نتایج به‌دست‌آمده از این تحقیق و با بهینه‌سازی‌های مناسب می‌توان در تشخیص سایر بیومارکرهای از جنس miRNA و در آزمایشگاه‌های کلینیکال استفاده نمود.
- Abstract
- Currently, blood circulating microRNAs have been introduced as new and validated biomarkers for application in early detection of diseases including cancers. The aim of this research was to design and fabricate precise sensors for quantification of miRNAs in real samples (serum/plasma) without any sample manipulation. To achieve this purpose, two sensors (an electrochemical biosensor and nanobiosensor) were developed for quantification of miR-155, as a biomarker related to the early phase of breast cancer progression. The electrochemical biosensor was based on gold electrode and specific thiolated oligonulcelotides for miR-155, and application of oracet blue as an electrochemical label. The electrochemical nanobiosensor was upon a glassy carbon electrode which were modified using graphene oxide and gold nanorods, and oracet blue as a label. To validate our methods, transmission electron microscopy (TEM) imaging, spectrophotometry, imaging and energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) using Field Emission Scanning Electron Microscope (FE-SEM), cyclic voltammetry (CV) and electrochemical impedance spectroscopy (EIS), were done. Selectivity of the sensors was assessed using a single-base mismatch, a three-base mismatch, completely unmatched oligonucleotide (miR-21) compared to the target miR-155. Real samples, serum and plasma, were used to prove the functionality of the sensors in clinical samples. The result of above analysis showed the correct assembly of the sensors. The electrochemical biosensor had a linear range from 50 pM to 15 nM with a detection limit of 13.5 pM, but the nanobiosensor had a linear range from 2.0 fM to 8.0 pM, and the detection limit was 0.6 fM. Both sensors showed high specificity and selectivity, so that they could discriminate between target miR-155 and single-base mismatch, three-base mismatch, completely unmatched oligonucleotides. Reproducibility, stability and functionality of the sensors in the real samples (serum/plasma) were found to be significant. Besides, it was found that the application of graphene oxide and gold nanorods could increase the sensitivity of the nanobiosensor compared to the biosensor, with ~6 fold more. In conclusion, this study described two sensors (electrochemical biosensor and electrochemical nanobiosensor) based on a novel electrochemical label, Oracet blue. Both sensors had a low detection limit and wide linear ranges with simplicity, less consumed time and low cost, which were superior to the most of previously published works. Our method reveals the potential for future application in clinical labs and also detection of other miRNA biomarkers through more optimizations. Keywords: Nanobiosensor, Biosensor, Electrochemical, breast cancer, early detection, MicroRNA, biomarker.
