عنوان پایان‌نامه
بررسی روشهای مختلف آنتی بادی در افزایش حساسیت باکتری ویبریوکلرا (عامل وبا) بوسیله حسگر رزونانس پلاسمون سطح(SPR)
- رشته تحصیلی
- نانوبیوتکنولوژی
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه دانشکده علوم و فنون نوین شماره ثبت: 487;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 77042;کتابخانه دانشکده علوم و فنون نوین شماره ثبت: 487;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 77042
- تاریخ دفاع
- ۲۶ مهر ۱۳۹۵
- دانشجو
- رمضانعلی طاهری
- استاد راهنما
- فرشته رحیمی, علی حسین رضایان قیه باشی
- چکیده
- چکیده اولین حسگر مبتنی بر پدیده تشدید پلاسمون سطحی (SPR) در سال 1998 با حد تشخیص cfu/ml 107 برای تشخیص باکتری E.coli O157:H7 گزارش گردید. پس از آن تلاشهای زیادی صورت گرفته است تا حد تشخیص کاهش داده شده و حساسیت تشخیص افزایش یابد. یکی از روشهای افزایش حساسیت تشخیص، تغییر نحوه تثبیت آنتی بادی بر سطح تراشه حسگر می¬ باشد. هدف از انجام این تحقیق بررسی قابلیت آنتی بادی علیه یک پروتئین سطحی باکتری ویبریو کلرا (anti-OmpW) در تشخیص حساس این باکتری با روش تشدید پلاسمون سطحی و مقایسه روشهای مختلف تثبیت آنتی بادی از جمله جذب فیزیکی، تثبیت کوالان با کمک تشکیل تک لایه خود آرا (SAM) آلکان تیول، تثبیت جهت دار آنتی بادی با استفاده از Protein G و تثبیت بر روی تک لایه خود آرا مخلوط در ایجاد پاسخ دستگاه تشدید پلاسمون سطحی می باشد. در این تحقیق آنتی ژن کلون شده نوترکیب OmpW، بیان و خالص شد و آنتی بادی پلی کلونال علیه این پروتئین در خرگوش تولید و خالص گردید. آنالیزهای تصویربرداری میکروسکوپ نیروی اتمی(AFM)، ATR–FTIR، زاویه تماس و الیپسومتری برای ارزیابی سطح تراشه های تغییر یافته انجام گرفت. نتایج این تحقیق نشان داد که تمایل اتصال بالای anti-OmpW به پروتئین سطحی نوترکیب با ثابت تفکیک M 9-10×4/2KD= نقش موثری در تشخیص حساس باکتری دارد. نتایج مقایسه¬ای روشهای محتلف تثبیت نیز بیانگر این بود که در اتصال کوالان آنتی¬بادی به سطح تراشه حسگر با کمک تشکیل تک لایه خودآرا (SAM) که بیشتر از سایر روشها مورد استفاده قرار می گیرد، بالاترین تراکم سطحی به دست می آید و کمترین تراکم سطحی مربوط به اتصال آنتی بادی بر روی تک لایه خود آرا مخلوط حاوی نسبت 80/20 از 11- مرکاپتو آندکانوئیک اسید/ 9- مرکاپتو- 1- نونانول بود. به منظور بهینه کردن تراکم سطحی در تثبیت کوالان، چهار غلظت مختلف (5/12، 25، 50 و 100 میکروگرم در میلی لیتر) آنتی بادی بر روی سطح تراشه طلای تغییر یافته با 11-MUA تثبیت شدند و حداکثر پاسخ میانکنش بین آنتی ژن و آنتی بادی در غلظت ?g/ml25 به دست آمد. حد تشخیص در این نانوبیوحسگر، 50 سلول باکتری در میلی لیتر و محدوده خطی تشخیص 107×1 تا 102× 1 سلول در میلی لیتر گزارش گردید. سیگنال پاسخ میانکنش آنتی بادی تثبیت شده و باکتری ویبریو کلرا به ترتیب ذیل بود: تثبیت جهت دار با استفاده از کمپلکس آنتی بادی/ Protein G < تک لایه خود آرا مخلوط 11-MUA و 9- مرکاپتو-1- نونانول < تک لایه خودآرا 11-MUA < جذب مستقیم فیزیکی. نتایج مقایسه ای بین تثبیت جهت دار با استفاده از کمپلکس آنتی بادی/ Protein G و تثبیت بر روی تک لایه خودآرا 11-MUA نشان¬دهنده افرایش حدود 15 درصدی حساسیت تشخیص در تثبیت جهت دار آنتی بادی بوده و حد تشخیص این نانوبیوحسگر 43 باکتری در میلی لیتر بدست آمد. برای ارزیابی اختصاصیت حسگرها، از باکتری¬های گرم مثبت و گرم منفی غیر مرتبط با جنس ویبریو و همچنین باکتری ویبریو پاراهمولیتیکوس استفاده گردید و اختصاصیت بیوحسگر طراحی شده به اثبات رسید. به منظور ارزیابی مطالعات شناسایی باکتری در نمونه های واقعی، آب های فاضلابی که به طور مصنوعی با باکتری ویبریو کلرا آلوده شده بودند مورد آزمایش قرار گرفتند و این نتیجه حاصل شد که به منظور کاهش جذب غیر اختصاصی و کاهش معضل انتقال جرم در نمونه های واقعی، بهتر است از تراشه های با سطح پوشش کم از قبیل تک لایه های خود آرا مخلوط استفاده گردد. کلمات کلیدی: تشدید پلاسمون سطح، ایمونوحسگر، ویبریو کلرا، تشخیص، روشهای تثبیت، OmpW
- Abstract
- Abstract Surface Plasmon Resonance (SPR) immunosensor for detection of bacterial cells was first reported in 1998 with high detection limit as much as 107cfu/ml. Since then, many efforts have been made aiming to lower the detection limit and improve sensitivity of detection. Surface plasmon resonance (SPR), a highly sensitive and label-free optical biosensing technique, is a powerful tool for studying biomolecular interactions. An immunosensor for rapid, sensitive, and selective detection of Vibrio cholerae on the basis of SPR is reported. Recombinant OmpW antigen (a bacterial outer-membrane protein) of V. cholerae was expressed and purified and raising of polyclonal rabbit anti-OmpW was done. Antibodies were immobilized on a sensor surface and interactions between OmpW protein and the whole cell of V. cholerae with immobilized antibodies were studied in different experiments. The aim of this study was to evaluate the potential of anti-OmpW in detection of V. cholerae by developing an immunosensor based on SPR. The results showed high affinity interaction between OmpW and anti-OmpW (KD=2.4±0.07×10-9 M) and SPR signals had a linear relationship with the number of V. cholerae ranging from 1×102 to 1×107 cells/mL with limit of detection of 50 cells/mL. The specificity of the developed immunoassay was examined using some non-V. cholerae bacteria which did not produce any significant responses. This method is rapid, sensitive, and specific to target V. cholerae with a total analysis time of less than 60 min. The aim of this study was to compare the effect of four most frequently used immobilization strategies including direct physical adsorption (physisorption), covalent immobilization via self-assembled monolayer (SAM) formation, bioaffinity immobilization using Protein G-mediated immobilization and using mixed SAM of alkane thiols on signal strength of detection of V. cholerae using these modified surfaces. The most widely used strategy, covalent binding of antibodies to sensor chip via SAM formation, gave the highest immobilization density and mixed SAM of 20/80 (v/v) of 11-MUA/9-mercapto-1-nonanol resulted in the least surface coverage in antibody immobilization step. To optimize surface density in covalent immobilization, four different concentrations (12.5, 25, 50, and 100 ?g/ml) of anti-OmpW were immobilized on 11-MUA modified gold disks and maximum interaction response was achieved at 25 µg/ml. The interaction response signals for detection of V. cholerae using immobilized anti-OmpW were in this order: Oriented immobilization using protein G/antibody complex > Mixed SAM of 11-MUA and 9-mercapto-1-nonanol > Homogenous 11-MUA SAM > Direct physical adsorption. In order to evaluate interaction studies in real sample condition, waste water samples that were artificially spiked with V. cholerae were tested and we concluded that for real samples, it is better to setup experiment with low surface coverage such as mixed SAM to overcome non-specific adsorption. Keywords: Surface Plasmon Resonance; Immunosensor; Vibrio cholerae; detection; OmpW antigen; Biomolecular interaction.
