عنوان پایان‌نامه
انتقال ژن رمز کننده اسید فسفاتاز ارغوانی (AtPAP۱۸) به سویا
- رشته تحصیلی
- ژنتیک مولکولی و مهندسی ژتتیک
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه پردیس ابوریحان شماره ثبت: 917;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 74904;کتابخانه پردیس ابوریحان شماره ثبت: 917;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 74904
- تاریخ دفاع
- ۳۰ خرداد ۱۳۹۵
- دانشجو
- مهدی یونسی حمزه خانلو
- استاد راهنما
- علی ایزدی دربندی, محسن ابراهیمی
- چکیده
- یکی از مکانیسم¬های طبیعی و مهم سازگاری گیاهان تحت شرایط کمبود فسفر، القاء و ترشح اسید فسفاتازها (APseها) می¬باشد. در بین APseها اسید فسفاتازهای ارغوانی (PAPs) به جهت دارا بودن طیف وسیعی از سوبسترا از اهمیت ویژه¬ای برخوردار هستند. بیش بیان ژن¬های PAP درگیاهان منجر به افزایش کارایی جذب فسفر در این گیاهان هم در شرایط کمبود فسفر و هم در حضور فسفر کافی، می¬شود. کارکرد اغلب PAPهای آرابیدوپسیس در سویا در پاسخ به جذب فسفر ناشناخته باقی مانده است. بنابراین در این پژوهش برای مطالعه کارکرد AtPAP18 در سویا، توالی کامل cDNA ژن AtPAP18 برای ایجاد سویاهای کمپوزیت با ریشه¬های مویین تراریخته در ناقل هدف به روش گیت وی همسانه سازی شد (35S::AtPAP18-GFP). در ادامه اثر بیش بیان این ژن روی خصوصیاتی نظیر تغییر فعالیت اسید فسفاتازی، مقدار فسفر کل و فسفر آزاد مورد ارزیابی قرار گرفت. برای تراریختی از روش تراریختی با Agrobacterium rhizogenes استفاده گردید. از آنجایی که هر سیستم تراریختی در گیاهان نیاز به یک سیستم باززایی مناسب دارد، یک سیستم باززایی مناسب از گره لپه¬ای نیز در دو رقم L17 و ویلیامز و یک لاین جهش یافته سویا بهینه سازی گردید تا در مراحل بعدی اقدام به تراریختی کل گیاه با استفاده از روش¬های تراریختی دیگر نظیر Agrobacterium tumefaciens نمود. نتایج نشان داد که استفاده از سیستم باززایی با استفاده از ریزنمونه گره لپه¬ای منجر به تولید تعداد زیادی گیاه کامل در مدت زمان کوتاه می¬شود به طوری که تقریباً بعد از دو ماه می¬توان به گیاه کامل دست یافت. درصد باززایی در این روش بالا بوده به طوری که همه ژنوتیپ¬های مورد بررسی باززایی بالای 60 درصد را نشان دادند و بیشترین درصد باززایی مربوط به لاین جهش یافته (بیش از 80 درصد) بود. آنالیز پروتئین فلورسنتی سبز (GFP) در ریشه¬های تراریخت نشان داد که سطوح بالایی از بیان GFP در ریشه¬های تراریخت وجود دارد در حالی که در ریشه¬های گیاه شاهد GFP قابل بیان برای آشکار سازی وجود نداشت. هچنین نتایج به وضوح وجود سیگنال قدرتمند فلورسنس را در سلول ریشه¬های تراریخت نشان داد در حالی که در سلول¬های ریشه¬های کنترل GFP قابل بیان برای آشکار سازی وجود نداشت. آنالیز RT-PCR سطوح بیان بالایی را در ریشه¬های گیاهان تراریخت نشان داد در حالی که در ریشه¬های کنترل ترانسکریپت AtPAP18 با استفاده از این پرایمرها تکثیر نشد. آزمایش آنزیمی مشخص کرد که پروتئین AtPAP18 موجود در ریشه¬های تراریخت دارای اثر معنی داری روی فعالیت APase در مقایسه با کنترل¬ها می¬باشد. فعالیت APase در ریشه¬های مویین تراریخت نسبت به کنترل تقریباً دو برابر افزایش نشان داد. در این تحقیق برای نشان دادن میزان متابولیسم Pi، سطوح فسفر کل و فسفر آزاد در برگ¬های گیاهان بیش بیان کننده AtPAP18 با ریشه¬های تراریخت و نیز در برگ¬های گیاهان کنترل اندازه گیری شد. سطوح هر دو شاخص در گیاهان با بیش بیان AtPAP18 در مقایسه با گیاهان کنترل بالاتر بود. همچنین نتایج به دست آمده نشان داد که بیش بیان این ژن منجر به بهبود خصوصیات مورفولوژیکی نیز می¬شود.
- Abstract
- Induction and secretion of acid phosphatase is one of the important and natural plant adaptation mechanisms under phosphorus deficiency. This type of non-specific acid phosphatase was mainly a special class of APase that form the largest group. Overexpression of PAP genes in the plants leads to increased plant P uptake efficiency under phosphorus deficiency and in the presence of sufficient phosphorus. Many of Arabidopsis PAPs function in soybean in response to phosphorus uptake remains unknown. So in this research to study the function of AtPAP18 in soybean, in this regard, cDNA sequence of AtPAP18 gene to create transgenic composite soybean with transformed hairy roots was cloned into destination vector using Gateway to determine the effect of overexpression of this gene on features such as changing the acid phosphatase activity, total and free phosphorus. For transformation of hairy roots, the Agrobacterium rhizogenes transformation method was used. Since any transformation systems need to a suitable regeneration system, one appropriate regeneration system from cotiledonary node was optimized in two L17 and Williams cultivars and one soybean mutant line in order to create whole transformed soybean using other methods like the Agrobacterium tumefaciens method in the future. Results showed that using cotiledonary node regeneration system leads to product many complete plant in short time, so that after two month it is possible to obtain complete plant. In this system percentage of regeneration is high, so that all of the genotypes showed more than 60 percent regeneration and highest regeneration belong to mutant line (more than %80). GFP analysis of transformed hairy roots showed high levels of GFP expression in transformed hairy roots while in control roots there was no detectable GFP expression. In addition, results indicated clearly powerful fluorescence signal in the transformed hairy roots cells while in control roots there was no detectable GFP expression.
