عنوان پایان‌نامه
غربالگری، بهینه سازی و تخلیص آنزیم لاکاز از میکروارگانیسم های نمک دوست و تحمل کننده نمک
- رشته تحصیلی
- زیست شناسی علوم میکروبیولوژی
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه پردیس علوم شماره ثبت: 6462;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 79219;کتابخانه پردیس علوم شماره ثبت: 6462;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 79219
- تاریخ دفاع
- ۲۶ بهمن ۱۳۹۵
- دانشجو
- مریم سیروسی
- استاد راهنما
- محمدعلی آموزگار
- چکیده
- میکروارگانیسم‌های نمک‌دوست و تحمل‌کننده‌ی نمک منابع بالقوه‌ای برای اهداف زیست‌فناوری هستند و مطالعه بر روی آنزیم‌های جدا شده از این میکروارگانیسم‌ها در طی سال‌های اخیر افزایش پیدا کرده است. لاکازها به دلیل اختصاصیت سوبسترایی کمی که دارند، از جمله آنزیم‌های بسیار مهم در زیست‌فناوری شناخته می‌شوند. پراکسیدازهای نوع Dyp-پراکسیداز نیز خانواده‌ی جدیدی از هم-پراکسیدازها هستند که در قارچ‌ها و باکتری‌ها شناخته شده‌اند و در رنگبری از رنگ‌ها نقش مهمی دارند. در این مطالعه بیش از 1200 سویه‌ی مختلف از میکروارگانیسم‌های نمک‌دوست و تحمل‌کننده‌ی نمک به منظور یافتن انواع تولید کننده آنزیم لاکاز غربال شدند. از بین این تعداد، هشت سویه متعلق به جنس Bacillus فعالیت لاکازی و یک سویه مربوط به جنس Kocuria فعالیت پراکسیدازی را از خود نشان دادند. فعالیت بهینه‌ی لاکاز اسپوری جدا شده از اسپورهای Bacillus sp. strain S31-3B در برابر سوبسترای ABTS در دمای C? 30 و 5 pH دیده شد. این آنزیم لاکاز اسپوری پس از کپسوله شدن در پلیمر آلژینات بر روی رنگ ری‌اکتیو بلک5 اثر رنگبری داشت، بدون اینکه از هیچ عامل واسطه‌ای استفاده شود. آنزیم لاکاز خارج سلولی از باکتری Bacillus sp. strain WT پس از رسوب دهی با آمونیوم سولفات و استفاده از روش کروماتوگرافی تعویض آنیونی با استفاده از رزین Q-سفارز خالص شد و جرم مولکولی آن kDa 180 تعیین شد. مقدار KM آنزیم در برابر سوبستراهای ABTS و SGZ به ترتیب به میزان 7/132 و µM 7/3 تعیین شد و میزان kcat نیز به ترتیب 309 و S-1 51 تعیین شد. ژن آنزیم مولتی‌کوپراکسیداز از آرکی نمک‌دوست XH-70(T) Halovivax ruber کلون شد و به صورت نوترکیب در میزبان واسطه‌ی Escherichia coli سویه‌ی BL21 بیان شد. این آنزیم پس از بیان و بعد از دیالیز در حضور M 2 از نمک NaCl فعالیت لاکازی داشت و به طور نسبی نیز تخلیص شد. آنزیم پراکسیداز جدا شده از باکتری Kocuria sp. strain Bss 7b با روش رسوب‌دهی پروتئین‌ها با آمونیوم سولفات و سپس تیمار حرارتی به طور نسبی خالص شد. شرایط بهینه برای فعالیت آنزیم دمای ?C90، غلظت M 5/4 از نمک NaCl و pH اسیدی 3-2/2 بود.
- Abstract
- Halophilic and halotolerant microorganisms are one of the most important groups of extremophiles. These microorganisms are potential sources for biotechnological applications, so many efforts have been focused on enzyme producing halophiles and halotolerants in recent years.Laccases are enzymes with low level of substrate specificity that makes them appropriate choices for biotechnological purposes. DyP-type peroxidases are a new superfamily of haem-peroxidases isolated from fungi and bacteria. Peroxidases can be used in different biotechnological applications such as decolorization of industrial synthetic dyes. More than 1200 different halophilic and halotolerant isolates and strains isolated from different saline and hypersaline environments in Iran, were screened for laccase production. Among them, eight different strains of the genus Bacillus showed laccase activity and one strain of the genus Kocuria showed peroxidase activity. Spores from Bacillus sp. strain S31-3b showed laccase activity and oxidized SGZ (syringaldazine) and ABTS (2,2’-azinobis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt). The maximum activity of the spore laccase was at 30 °C and pH 5, toward ABTS as the substrate. Encapsulated spore laccase in alginate polymer decolorized reactive black 5, without any addition of redox mediator.An extracellular enzyme from a halotolerant bacterium, Bacillus sp. strain WT, showed laccase activity toward syringaldazine and ABTS. The enzyme with apparent molecular mass of 180 kDa was purified using ammonium sulfate precipitation method and anion exchange chromatography. KM values for the purified enzyme on ABTS and syringaldazine were determined to be 132.7 and 3.7 µM, with corresponding kcat values of 309 and 51 s?1, respectively. A polyphenol oxidase gene from Halovivax ruber XH-70(T) was cloned and expressed as a recombinant enzyme with laccase activity, using Escherichia coli strain BL21 as a heterologous host. The enzyme showed activity only after dialysis against a buffer containing 2 M NaCl and also, the enzyme was partially purified.The halotolerant bacterium Kocuria sp. strain Bss-7b produced a novel poly-extremophilic peroxidase. The enzyme was partially purified using ammonium sulfate precipitation and thermal treatment methods and then, characterized. The optimal temperature for the peroxidase activity was 90 °C. The enzyme exhibited halophilic nature and showed optimum activity at 4.5 M. The peroxidase activity was maximum at acidic pH values with optimum activity at pH 2.2-3 and the enzyme lost most of its activity at higher pH values.
