عنوان پایان‌نامه
طراحی و ساخت کاست ژنی pvax/iuta(اشریشیا کلی یوروپاتوژن )و پروتئین نوترکیب آن به عنوان ایموژن علیه عفونت ادراری و ارزیابی ایمنی زایی آنها در مدل موش آزمایشگاهی
- رشته تحصیلی
- بیوشیمی
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک شماره ثبت: 11419ب;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 69470
- تاریخ دفاع
- ۱۱ شهریور ۱۳۹۴
- دانشجو
- روناک بختیاری
- استاد راهنما
- شهین احمدیان
- چکیده
- چکیده عفونت دستگاه ادراری یکی ازشایعترین عفونت¬ها در انسان محسوب می¬شود وسویه¬های اشریشیا کلی یوروپاتوژن شایعترین عامل آن هستند. این سویه¬ها در مثانه کلونیزه شده و باعث سیستیت می¬شوند اما می¬توانند به سمت کلیه¬ها حرکت کنند و عامل پیلونفریت شوند. از آنجائیکه پروتئین IutA در کسب آهن و ایجاد عفونت نقش بسیار مهمی دارد در تحقیق حاضر، به عنوان کاندید ایمونوژن انتخاب گردید. از اشریشیا کلی سویه 35218 ، DNA ژنومی استخراج گردید و ژن iutA با PCR تکثیر شد. محصول PCR در وکتور pBlueScript SK کلون شده و با توالی¬یابی تایید گردید. برای ساب کلونینگ،PCRانجام شده و محصول PCRدر وکتورهای بیانی pET23a و pVax وارد شد. کلون¬های بدست آمده pET/iutA و pVax/iutA با توالی¬یابی تایید شده و در اشریشیا کلی سویه (DE3)Origami و رده سلولی COS7 وارد شدند. بیان پروتئین نوترکیب IutA در باکتری با Western Blot تایید گردیده و با کروماتوگرافی افینیتی تخلیص شد. همچنین بیان کاست pVax/iutA در رده سلولی COS7 با RT-PCR تایید شد. به پنج گروه موش بترتیب پروتئین IutA ، pVax ، ادجوانت ، PBS و pVax/iutA در دو مرحله تزریق شد و یک هفته پس از تزریق دوم خونگیری شده و در سرم آنها تیترIgG و زیرکلاس¬های IgG1 و IgG2a اندازه¬گیری شد. همچنین تیتر IL.4 و IFN-? اندازه¬گیری شدند. موش¬های ایمن¬شده با تزریق یکصد میلیون اشریشیا کلی 35218 در مثانه مورد چالش قرار گرفتند. دو روز پس از تزریق باکتری، مثانه خارج شده و کشت داده شد. میزان ایمن¬شدن در گروه دریافت¬کننده پروتئین بیشتر از گروه دریافت¬کننده DNA واکسن بود، علیرغم آنکه گروه اخیر پاسخ ایمنی سلولی بالاتری داشته است. بعبارتی پاسخ ایمنی هومورال در پیشگیری از کلونیزاسیون باکتری در مثانه موثر بوده و پاسخ ایمنی سلولی در پیشگیری از عود عفونت می¬تواند موثر باشد. واژگان کلیدی: عفونت ادراری، اشریشیا کلی یوروپاتوژن، واکسن نوترکیب، واکسن ژنی، پروتئینIutA چکیده عفونت دستگاه ادراری یکی ازشایعترین عفونت¬ها در انسان محسوب می¬شود وسویه¬های اشریشیا کلی یوروپاتوژن شایعترین عامل آن هستند. این سویه¬ها در مثانه کلونیزه شده و باعث سیستیت می¬شوند اما می¬توانند به سمت کلیه¬ها حرکت کنند و عامل پیلونفریت شوند. از آنجائیکه پروتئین IutA در کسب آهن و ایجاد عفونت نقش بسیار مهمی دارد در تحقیق حاضر، به
- Abstract
- Abstract Urinary Tract Infection (UTI) is one of the most infectious diseases in human and Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) strains are the major agents of UTI. These strains colonize in bladder tissue and cause cystitis. Moreover, UPEC cause pyelonephritis if they get to kidneys. Seeing as IutA has a main role in iron acquisition and consequently causing infection, it is therefore selected as a candidate immunogen in this study. Genomic DNA was extracted from E. coli 35218 and iutA gene amplified by PCR. The amplicon was cloned to pBluescript vector and confirmed by sequencing. Subsequently, iutA was amplified and inserted into pET23a and pVax expression vectors. Finally pET/iutA and pVax/iutA clones were verified by DNA sequencing and transferred to E. coli origami (DE3) strain and COS7 cell line, respectively. Expression of recombinant IutA in E. coli was validated by western blot method and purified by affinity chromatography. Additionally, efficiency of pVax/iutA expression in COS7 was verified by RT-PCR. The mouse model used in this study was which were divided into five groups and they injected with the IutA recombinant protein, pVax vector, adjuvant, PBS and pVax/iutA cassette, respectively, in two stages. One week after the second injection, bleeding from immunized mouse was performed and IgG, IgG1 and IgG2a sub classes were measured. Furthermore, IL- 4 and IFN gamma titers were evaluated. In challenge stage, 107 E. coli 35218 cells were injected into the bladder tissue of immunized mice and extracted two days later, homogenized and cultured on nutrient agar plates. Potency of immunization was more in mice receives IutA protein than DNA vaccine, in spite of the latter group showing a higher cellular immune response. The results signify that humoral immune response has a major role in prevention of bacterial colonization on bladder and cellular immune response could be efficient in preventing recurrent infection. Key words: Urinary Tract Infection
