عنوان پایان‌نامه
بررسی حفظ حالت خود مهاری پروتئین apaf-۱انسانی با استفاده از جهش زایی هدف دار در اسید آمینه گلوتامات ۵۴۶
- رشته تحصیلی
- بیوشیمی
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک شماره ثبت: 11416ب;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 69688
- تاریخ دفاع
- ۲۳ شهریور ۱۳۹۴
- دانشجو
- راحله شاکری
- استاد راهنما
- سوسن کبودانیان اردستانی
- چکیده
- یکی از عوامل کلیدی در مسیر میتوکندریایی آپوپتوز، پروتئینی به نام Apaf-1 است که در شرایط فیزیولوژیک به فرم خودمهاری در سیتوزول وجود دارد. استرس¬های درون¬سلولی مانند آسیب DNA، مواجهه با UV و داروهای سیتوتوکسیک با نفوذپذیرنمودن غشای خارجی میتوکندری موجب رها شدن سیتوکروم c از فضای بین¬غشایی این ارگانل به سیتوزول می¬گردند. سیتوکروم c در سیتوزول با اتصال به Apaf-1 و القای تغییر کانفورماسیون، کمپلکس بزرگی به نام آپوپتوزوم تشکیل می¬دهد که متشکل از هفت مولکول Apaf-1 متصل به سیتوکروم c و dATP و هفت پروکاسپاز-9 است. آپوپتوزوم با فعال نمودن پروکاسپاز-9، آپوپتوز را در سلول به راه می¬اندازد. Apaf-1 از سه دمین ِ CARD، NOD و WRD تشکیل شده است. در ساختار کریستالی این مولکول، سه پل نمکی بین WRD و NOD وجود دارد که به نظر می¬رسد در حفظ حالت خودمهاری مولکول نقش داشته باشند و با اتصال سیتوکروم c و تغییر کانفورماسیون در WRD، این پل¬ها شکسته شده و Apaf-1ها الیگومریزه ¬گردند. در این پایان¬نامه نقش پل نمکی بین گلوتامات 546 با آرژنین 907 در حفظ حالت خودمهاری Apaf-1 انسانی بررسی شد. برای شکستن این پل نمکی، گلوتامات 546 مولکول Apaf-1 انسانیِ کلون شده در پلاسمید pcDNA3.1، به دو اسیدآمینه¬ی گلوتامین (بدون¬بار) و آرژنین (با بار هم¬نام) با روش جهش¬زایی هدفدار جهش داده شد. پلاسمید حاوی Apaf-1 وحشی و دو پلاسمید حاوی جهش¬های فوق در سلول HEK293T ترانسفکت شد و توانایی آن¬ها در القای آپوپتوز در غیاب رها شدن سیتوکروم c با روش فلوسایتومتری و وسترن بلات با آنتی¬بادی بر علیه کاسپاز-3 بررسی شد. نتایج نشان داد که بیان بالای Apaf-1 سبب القای آپوپتوز در سلول HEK293T در غیاب رها شدن سیتوکروم c نمی¬شود و تفاوتی میان Apaf-1های وحشی و جهش¬یافته در القای آپوپتوز وجود ندارد. بررسی دقیق¬تر توانایی Apaf-1های جهش¬یافته نسبت به وحشی در تشکیل آپوپتوزوم و فعال نمودن پروکاسپاز-9 تحت شرایط in vitro در سلول MEF(-/-Apaf-1) نشان داد پل نمکی بین گلوتامات 546 با آرژنین 907 برای حفظ حالت خودمهاریِ مولکول، کلیدی نیست چرا که شکستن این پل تاثیری بر توانایی Apaf-1 در الیگومر شدن و فعال نمودن پروکاسپاز-9 ندارد. اما بررسی توانایی Apaf-1های وحشی و جهش¬یافته در تشکیل آپوپتوزوم و فعال نمودن پروکاسپاز-9 در سلول HEK293T تحت شرایط in vitro نش
- Abstract
- Abstract One of the key factors in the mitochondrial pathway of apoptosis, a protein called Apaf- 1, which has auto-inhibited form in the cytosol in physiological conditions. Cellular stresses such as DNA damage, UV irradiation and cytotoxic drugs by permeabilization of outer mitochondrial membrane leads to the release of cytochrome c from the intermembrane of this organelle to cytosol. Cytochrome c binds Apaf-1 in cytosol, induces conformational changes and forms a large complex known as apoptosome that is composed of seven Apaf-1 molecules bind to cytochrome c, dATP and procaspae-9. Apoptosome trigger apoptosis in cells by activating procaspase-9. Apaf-1 is composed of three domains including CARD, NOD and WRD. Three salt bridges between WRD and NOD has shown in the crystal structure of this molecule that seems preserve autoinhibited form of the molecule and upon cytochrome c binding and conformational changes in WRD, these bridges has broken and Apaf-1 can be oligomerized. In this thesis, the role of the salt bridge between glutamate 546 with arginine 907 in preservation of autoinhibited form of human apaf-1 has investigated. For the salt bridge broken, glutamate 546 of human Apaf-1 molecule cloned in pcDNA3.1 plasmid is mutated to glutamine and arginine using Quick change method. Plasmid contains the Wild type Apaf-1 and two plasmids contain mutated Apaf-1 were transfected in HEK293T cells and their ability in apoptosis induction in the absence of cytochrome c release were investigated by flow cytometry and western blot with antibody against caspase-3. Results showed that Apaf-1 overexpression does not induce apoptosis in HEK293T cells in the absence of cytochrome c release and there was no difference between wild type and mutants Apaf-1 in apoptosis induction. A closer study of the ability of mutants Apaf-1 relative to wild type in apoptosome formation and procaspase- 9 activation, in vitro, in MEF(-/-Apaf-1) cells showed that the salt bridge between glutamate 546 with arginin 907 is not critical residue, because its breaking does not affect the ability of Apaf-1 in oligomerization and procaspase-9 activation. But investigation the ability of wild type and mutants Apaf-1 in apoptosome formation and procaspase-9 activation in HEK293T cell line, in vitro, showed that wild type and mutants Apaf-1 are able to apoptosome formation and procaspase-9 activation in the presence or absence of exogenous cytochrome c and dATP but cleavage pattern of procaspase-3 by these apoptosomes is different in the presence or absence of exogenous 93 cytochrome c and dATP. Cleavage pattern of procaspase-3 by wild type and mutants exogenous Apaf-1 in the absence of cytochrome c and dATP is similar to endogenous Apaf-1 while in the presence of exogenous cytochrome c and dATP, a cleaved form of procaspase-3 with 30 kDa has been identified. Detailed examination of why and how this cutting pattern is in progress
