عنوان پایان‌نامه
مطالعات بیوشیمی فیزیکی اثر مایعات یونی بر ساختار و عملکرد انزیم کولین اکسیداز با استفاده از نانوکامپوزیت نانو لوله کربنی /مایع یونی/آبی پروس
- رشته تحصیلی
- بیوشیمی
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک شماره ثبت: 11421ب;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 69942
- تاریخ دفاع
- ۲۴ شهریور ۱۳۹۴
- دانشجو
- امیرهمایون کیهان
- استاد راهنما
- علی اکبر موسوی موحدی
- چکیده
- چکیده: مایعات یونی توانایی خود را به عنوان بستری جدید برای واکنش‌های زیستی نشان داده‌اند که این توانایی مرهون ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی قابل تغییر آنها می‌باشد. طبیعت یونی این مواد در متأثر نمودن کارائی آنزیم حائز اهمیت فراوان می‌باشد. مطالعه ساختار پروتئین در حضور مایعات یونی برای درک نحوه فعالیت آنزیمی ضروری است. در این مطالعه، برای نخستین بار، ساختار آنزیم کولین‌اکسیداز استخراج شده از گونه آلکالیژنز در حضور پنج مایع یونی دارای کاتیون مشتق از ایمیدازولیوم (1- بوتیل- 3- متیل ایمیدازولیوم تترافلوئوروبورات، 1- بوتیل- 3- متیل ایمیدازولیوم دی‌سیانامید، 1- بوتیل- 3- متیل ایمیدازولیوم نیترات، 1- آلیل- 3- متیل ایمیدازولیوم برومید و 1- متیل- 3- پروپیل ایمیدازولیوم کلرید) و تترابوتیل آمونیوم تارتارات با روش طیف سنجی فلورسانس مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج فلورسانس نشان داد که مایعات یونی مورد استفاده باعث ایجاد پدیده خاموشی فلورسانس در آنزیم میشوند. همچنین این مواد قادر به ایجاد پدیده خاموشی در فلورسانس مربوط به گروه فلاوین آدنین دی‌نوکلئوتید (FAD) آنزیم هستند که نشان دهنده ایجاد تغییر در وضعیت جایگاه این گروه در ساختار آنزیم در نتیجه حضور مایعات یونی می‌باشد. بنابراین پدیده خاموشی ایجاد شده در این آنزیم تنها مربوط به حضور مایعات یونی نمی‌باشد بلکه بخشی از آن در نتیجه ایجاد تغییرات ساختاری آنزیم در نتیجه حضور این مواد در محیط واکنش است. با این وجود، تغییرات ساختاری در این آنزیم به واسطه حضور یدید سدیم و اکریل آمید ، به ترتیب به عنوان خاموش کننده دینامیک و استاتیک، در حضور مایعات یونی مورد تأیید قرار گرفت. ثابتها و توابع اشترن- ولمر محاسبه شده در حضور این مواد نشان داد که هر کدام از آنها با روش متفاوتی باعث تغییر ساختار آنزیم میشوند. این گزارش، روشی ساده و قابل دسترس را جهت مطالعه ساختار هر آنزیمی در حضور مایعات یونی با استفاده از طیف سنجی فلورسانس ارائه می‌دهد. علاوه بر این، در این مطالعه با استفاده از نانوکامپوزیتی متشکل از نانولوله‌های کربنی شبیه بمبو، مایع یونی و آبی پروس زیست‌حسگر آمپرومتری بسیار حساسی جهت شناسایی کولین طراحی گردید. برای این منظور، در ابتدا نانوذرات آبی پروس به روش الکتروشیمیایی بر روی الکترود تغییر یافته با نانولوله‌های کربنی و مایع یونی تثبیت شد. س
- Abstract
- Abstract: Ionic liquids (ILs) have shown potentials as a new reaction medium for biocatalysis, mainly due to their unique and tunable physicochemical properties. Their unique ionic nature is important in affecting the enzyme performance. The study of protein conformation in presence of ionic liquids (ILs) is crucial to understand enzymatic activity. In this work, for the first time, the structure of the choline oxidase from Alcaligenes sp. (ChOx, EC: 1.1.3.17) in presence of the five imidazolium-based ILs (1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate [BMIM]BF4, 1-Butyl-3-methylimidazolium dicyanamide [BMIM]N(CN)2, 1-butyl-3-methylimidazolium nitrate [BMIM]NO3, 1-allyl-3-methylimidazolium bromide [AMIM]Br, 1-Methyl-3- propylimidazolium chloride [MPIM]Cl) and tetrabutyl ammonium tartrate (TBAT) is studied by fluorescence spectroscopy. The UV-vis spectroscopic analysis shows that the light absorption of these ILs is located in the excitation and emission wave length of the indole groups of the enzyme. The Stern-Volmer analysis clearly shows that these ILs are quenchers of the indole group fluorescence. Fluorescence spectra of the flavin adenine dinucleotide (FAD) group of ChOx shows that these ILs quench the fluorescence of this group too. Therefore, fluorescence quenching of ChOx by ILs could not be directly related to the ILs but also some of these quenching is related to the conformational changes of the enzyme in the presence of ILs. Nevertheless, the structural changes of the ChOX could be evaluated with iodide (dynamic) or acrylamide (static), as secondary quenchers, demonstrating the relevance of conformational changes. The Stern-Volmer constants, calculated in the presence of the different ILs, demonstrate that these ILs are denaturing agents, each one acting with a different mechanism. This report provides a suitable and easy-to-apply method to study any enzyme structures in the presence of ILs by fluorescence spectroscopy. In addition, a highly sensitive amperometric choline biosensor was fabricated using bamboo-like multi-walled carbon nanotubes (BCNTs)/ionic liquid (IL)/Prussian blue (PB) nanocomposite modified glassy carbon (GC) electrode. The PB nanoparticles were first electrodeposited on the surface of a BCNTs/IL/GC electrode. The Ni2+ ions were then electrochemically incorporated into the PB structure to improve its stability in mild alkaline media. Choline oxidase was next immobilized on the modified electrode using a cross-linking method. Amperometric measurements of choline were performed at ?0.05 V vs. Ag/AgCl in 0.05 M phosphate buffer, pH 7.4. The choline biosensor exhibited a high sensitivity of 345.4 µA mM?1 cm?2 with a detection limit of 4.5 × 10?7 M. The amperometric response was linear from 4.5 × 10?7 to 1.0 × 10?4 M. The proposed biosensor displayed a short response time of 2 s, low Km value of 9.7 × 10?5 M, good storage stability and high selectivity. Keywords: ionic liquid, choline oxidase, Stern-Volmer equation, carbon nanotube, biosensor, prussian blue
