عنوان پایان‌نامه
<الگوی بیان ژن های دخیل در مسیر بیوسنتزی تاکسول در سرخدار (. Taxus baccata L) و کاربرد نانو ذرات در خالص سازی آن >
- رشته تحصیلی
- اصلاح نباتات - ژنتیک مولکولی و مهندسی ژنتیک
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی شماره ثبت: 6783;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 73440;کتابخانه مرکزی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی شماره ثبت: 6783;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 73440
- تاریخ دفاع
- ۲۰ بهمن ۱۳۹۴
- دانشجو
- جابر نصیری
- استاد راهنما
- محمدرضا نقوی
- چکیده
- در اولین بخش این تحقیق، تاثیر چهار فاکتور اقلیمی (یعنی، طول روز، درجه حرارت، ساعات روشنایی یا شدت نور و رطوبت نسبی) بر میزان بیان ژن‌های کلیدی دخیل در مسیر بیوسنتزی تاکسول (یعنی، TXS، DBAT، BAPT وDBTNBT ) و میزان تجمع تاکسان های مربوطه (یعنی، تاکسول،BAC III و 10-DBA III) در گیاه سرخدار طی یک بازه زمانی 12 ماهه در سال 1393-1392 مورد بررسی قرار گرفت. در هر دو بافت مورد مطالعه (برگ و ساقه)، شدت نور و دما با میزان تجمع 10-DAB III و مجموع تاکسان ها و همچنین فعالیت ژن TXS همبستگی چشمگیری نشان داد، در حالی که برای طول روز و رطوبت نسبی همبستگی معنی‌داری مشاهده نشد. همچنین، در هر دو بافت، همبستگی پایینی بین تولید BAC III و شدت نور، دما، طول روز و رطوبت نسبی و میزان فعالیت ژن DBAT مشاهده شد. جالب اینکه، در هر دو بافت، فعالیت ژن DBAT با TXS همراستا نبود، به گونه‌ای که میزان فعالیت ژن DBAT نوسانات کمی نشان داد، اشاره بر این واقعیت دارد که در مسیر بیوسنتزی تاکسول مرحله تبدیل 10-DAB III به BAC III یک مرحله محدود کننده محسوب می‌شود. مشابه با BAC III، همبستگی معنی‌داری بین تولید تاکسول و تمامی فاکتورهای اقلیمی مورد استفاده در این تحقیق مشاهده نشد، اما برای دو ژن BAPT و DBTNBT در برخی موارد همبستگی‌های معنی‌داری مشاهده شد. نکته قابل توجه اینکه، علیرغم فعالیت بالای دو ژن BAPT و DBTNBT در هر دو بافت مورد مطالعه، تولید تاکسول همچنان پایین بود، که این امر را احتمالا می توان به وجود مقادیر پایین پیش‌ماده تاکسول و نه میزان فعالیت دو ژن BAPT و DBTNBT نسبت داد. این نتایج، درمجموع، نقش احتمالی فاکتورهای اقلیمی فوق الذکر را در میزان تولید و تجمع تاکسان‌ها را در گیاه سرخدار مشخص می‌نماید. در دومین بخش از این تحقیق، به منظور انتخاب بهترین محیط‌های نگهدارنده کالوس (تهیه شده با L-glutamine یا Casamino acid) حاصل از بافت برگ و ساقه گیاه سرخدار، از یک روش تغییر یافته فرایند تحلیل سلسله مراتبی (AHP) مبتنی بر استخراج گزینه‌های غالب و بر مبنای 5 متغیر استفاده شد. بطورکلی، از بین 18 محیط نگهدارنده مورد مطالعه حاوی کالوس‌های مشتق شده از ساقه، تنها 6 محیط نگهدارنده بصورت غالب استخراج شدند و نهایتا، رتبه‌بندی این 6 محیط به صورت A12>A9>A15>A19>A3>A8 گزارش شد. از بین 18 محیط نگهدارنده مورد مطالعه حاوی کالوس‌های مشتق شده از برگ، تنها 6 محیط نگهدارنده (یعنی، A3، A8، A9، A4،A5 و A6) مبتنی بر L-glutamine بصورت غالب گزارش شدند و نهایتا رتبه‌بندی آنها بصورت A3>A9>A5>A6>A4>A8 ثبت شد. این نتایج نشان داد که برای بافت برگی، محیط‌های نگهدارنده مبتنی بر L-glutamine، در مقایسه با Casamino acidبنظر از کارایی بیشتری برخوردار است ولی برای ساقه هر دو منبع اسید آمینه کارایی تقریبا مشابهی دارند. در سومین بخش این تحقیق، پتانسیل سه نانوجاذب Fe3O4Nps@GO، Fe3O4 خالص، GO همراه با پودر گرافیت در فرایند پیشتخلیص تاکسول موجود در عصاره بدست آمده از برگ گیاه سرخدار مورد بررسی قرار گرفت. نتایج HPLC و طیف UV-Vis نشان داد که در حلال‌های با قطبیت پایین‌تر (یعنی دی‌کلرومتان)، میزان جذب متاثر از جاذبه¬های الکترواستاتیک می‌باشد، در حالی که در حلال‌های با قطبیت بیشتر (یعنی، استون و اتانول)، اندرکنش‌های الکترونی ?-? بین جاذب و جذب شونده مهمترین نقش را ایفا می‌کنند. با در نظر گرفتن میزان خلوص تاکسول، قدرت رنگ‌بری و قدرت بازیابی و استفاده مجدد جاذب‌های مورد مطالعه، جاذب Fe3O4Nps@GO و حلال دی‌کلرومتان به ترتیب بعنوان بهترین جاذب و حلال انتخاب شدند. درضمن، طبق مطالعات مدل‌های سینتیکی، فرایند جذب در طول 120 دقیقه به تعادل رسید که با مدل شبه-درجه-دوم کاملا منطبق بود. درضمن، مدل ایزوترم جذب لانگمور با داده‌های تعادلی جذب برای غلظت‌های مختلف عصاره اولیه (mg/L 2000-500) کاملا همبستگی نشان داد. در چهارمین بخش این تحقیق، پس از انتخاب جاذب Fe3O4Nps@GO بعنوان بهترین نانوجاذب برای فرایند پیشتخلیص تاکسول، نقش احتمالی سه فاکتور مهم (یعنی، میزان جاذب، دمای جذب و قدرت تکانش) بر میزان دو پاسخ (یعنی حذف رنگدانه‌های گیاهی و بهبود خلوص تاکسول) مورد آزمون قرار گرفت و با استفاده از مدل سطح پاسخ (RSM) بهینه شد. برای هر دو مدل رگرسیونی چند جمله‌ای درجه دو ارائه شده برای دو پاسخ، همبستگی بالایی بین داده‌های تجربی و پیش‌بینی شده بدست آمد (p<0.0001). درضمن، نتایج بهینه‌سازی عددی کلی نشان داد که برای دستیابی به بیشترین مقدار رنگ‌بری (0/94 درصد) و تاکسول با خلوص بیشتر (4/11 درصد)، مقادیر جاذب، درجه حرارت و قدرت تکانش محیط واکنش بایستی به ترتیب بصورت 7/37 گرم بر لیتر، 7/30 درجه سانتی‌گراد و rpm 1/153 تنظیم شود و در ادامه نتایج پیش بینی شده بصورت تجربی تایید شدند. درضمن، پس از 5 بار تیمار عصاره با نانوجاذب، قدرت مغناطیسی و جذب نانوجاذب برای حذف ترکیبات رنگی و دیگر ناخالصی‌ها (بالای 90 درصد) همچنان قابل قبول بود. نهایتا با توجه به نتایج ChIP، بنظر می رسد که ماشین سلولی در گیاه سرخدار، با توجه به نوع، شدت و کیفیت فاکتورهای اقلیمی، تغییرات هیستونی متفاوت و احتمالا حالات مختلف متیلاسیون DNA را به خدمت می گیرد.
- Abstract
- The first part of this work was undertaken to elucidate the consequences of some environmental cues (i.e., day length, temperature, hours of sunlight and relative humidity) on the expression patterns of TXS, DBAT, BAPT and DBTNBT genes contributed to the taxol biosynthetic pathway along with the accumulation of some taxanes in needles and stems of T. baccata over year 2013-2014. In both tissues, light intensity and temperature correlated with the production of 10-DAB III and total taxanes, and TXS activity, while a lack of significant association was deduced for day length and relative humidity. Furthermore, in both tissues, a weak correlation was observed between BAC III and light intensity, temperature, day length and relative humidity, and the corresponding gene, DBAT. Surprisingly, DBAT activity was not co-induced with TXS in both tissues, and remained expressed at basal levels over year, supporting that the conversion of 10-DAB III into BAC III could presumably be a rate limiting step in the Taxol biosynthetic pathway. Similar to BAC III, no strong correlation was detected between production of taxol in both tissues and all the meteorological data, while the corresponding genes BAPT and DBTNBT, in some cases, exhibited significant correlated results. Notably, despite higher activities of BAPT and DBTNBT in both tissues over year, taxol production was still in small quantities, probably owing to the low amounts of precursors rather than low volumes of BAPT and DBTNBT transcripts. The results, altogether, could provide us new insights towards the potential regulatory roles of environmental cues on production of taxanes in yew trees. As the second part of this work,, a modified analytic hierarchy process (AHP) approach based on refinement assay of non-dominated alternatives was employed to monitor the most reliable callus maintenance media (supplemented with L-glutamine and Casamino acid) of T. baccata callus cultures in terms of five criteria. Generally, regarding stem-derived calli, 6 out of 18 maintenance media were nominated as non-dominated alternatives, and following AHP ranking test Casamino acid-based media (i.e., A12, A15 and A19) were overall nominated as the premiere. Taking leaf-derived calli into account, only L-glutamine-based media in an ascending order of A8, A4, A6, A5, A9 and A3 were introduced as non-dominated alternatives. Such results, connote that L-glutamine-based feeding appears to generate more significant results either for calli growth continuously or taxanes production, while, for stems, both amino acid supplies had fairly equal worth. As the third part of this work, the potencies of three novel candidate nano-adsorbents (i.e. Fe3O4 nanoparticles (Fe3O4Nps), graphite oxide (GO), and their hybrids Fe3O4Nps/GO) followed by commercial graphite were compared one another in pre-purification of crude paclitaxel extract obtained from fresh needles of yew tree. HPLC and UV–Vis spectroscopy results demonstrate that in less polar solvent (i.e., dichloromethane), the adsorption is greatly affected by the electrostatic attractions, while in more polar solvents (i.e., acetone and ethanol) ?-? electron interactions taking place between adsorbent and adsorbate are the most dominant factors in sorption. Considering decolorization efficiency, purity of taxol, recovery and reusability of adsorbents, Fe3O4NPs@GO (50 g/L) in dichloromethane was selected as the best medium for pre-purification of paclitaxel. Additionally, in kinetic studies the sorption equilibrium could be reached within 120 min, and the experimental data were well fitted by the pseudo-second-order model. The Langmuir sorption isotherm model correlated well with the sorption equilibrium data for the crude extract concentration (500-2000 mg/L). As the fourth part of this work, subsequent to the selection of Fe3O4NPs@GO as the best nano-adsorbent, the potential roles of three crucial criteria (i.e., adsorbent dosage, sorption temperature and agitation/shaking power) on the two responses [i.e., efficiency of plant pigments removal (EPPR) and efficiency of taxol purity (ETP)] were examined and simultaneously optimized through response surface methodology (RSM). For both proposed second-degree polynomial regression models, highly significant correlations were achieved between the experimental and predicted data (p<0.0001). Meanwhile, the optimum conditions to simultaneously acquire the maximum EPPR (94.0 %) and ETP (11.4 %) were recorded as adsorbent dosage of 37.7 g L–1, sorption temperature of 30.7 °C and agitation power of 153.1 rpm; and the predictive results were confirmed using experimental rechecking survey. Interestingly, upon five consecutive treatments, the nanocomposite exhibited still substantial potency in eliminating large amounts of plant pigments and impurities (up to 90 %), without significant reduction on sorption capacity and magnetism thereof. Considering the ChIP-based results, finally, it could be concluded that the plant cellular machinery in Taxus spp., under outdoor circumstances, may recruit different histone modifications and probably DNA methylation statuses (i.e., hyper- and hypo-methylation), depending on the kind, quantity and quality of different environmental cues. Keywords: Taxol, Nano-adsorbent, Taxus baccata, Gene expression, Callus culture, Analytic hierarchy process (AHP), Response surface methodology (RSM), Epigenetics, Native chromatin immunoprecipitation (N-ChIP).
