عنوان پایان‌نامه
بررسی گروههای فیلوژنتیک و پاتوتیپ های جدایه های اشرشیاکلی رمز کننده ژن های بتالاکتاماز وسیع الطیف ESBLs در سویه های جداشده از طیور
- رشته تحصیلی
- باکتری شناسی
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه دانشکده دامپزشکی شماره ثبت: 615 ت;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 71843;کتابخانه دانشکده دامپزشکی - مخزن مرد آباد شماره ثبت: 615 ت
- تاریخ دفاع
- ۲۸ شهریور ۱۳۹۴
- دانشجو
- فاطمه دره گیرایی
- استاد راهنما
- بهار نیری فسایی
- چکیده
- پیش‌زمینه مطالعه: استفاده از آنتی‌بیوتیک‌ها در طیور باعث بروز مقاومت‌های آنتی‌بیوتیکی در سویه‌های اشریشیا کلی همزیست در دستگاه گوارش آن‌ها می‌شود و به عنوان تهدید بهداشت عمومی محسوب می‌گردد. هدف: هدف این مطالعه بررسی تغییرات الگوهای مقاومت آنتی‌بیوتیکی، شیوع و تنوع بتالاکتامازهای وسیع‌الطیف (ESBLs) در جدایه‌های اشریشیا کلی مدفوعی طیور و کارگران مربوطه در هفته اول ورود جوجه‌ها به گله و هفته آخر دوره پرورش می‌باشد. روش‌کار: 500 نمونه سواپ کلوآک از طیور گوشتی و 25 سواپ رکتال از کارگران مربوط به پنج مرغداری اطراف تهران و در طی دو فاز نمونه‌گیری بدست آمد. سواپ‌ها مستقیما بر روی محیط مک کانکی کشت داده شدند. آزمایشات مربوط به شناسایی جدایه‌های اشریشیا کلی، حساسیت آنتی‌بیوتیکی، تشخیص فنوتیپی ESBLs، استخراج پلاسمیدهای سویه‌های اشریشیا کلی ESBLs مثبت با روش لیز قلیایی و بدست آوردن الگوی پلاسمیدی این سویه‌ها، شناسایی و بررسی ژن‌های blaESBLs با کمک PCR و سکانس محصولات بدست آمده و آزمایش ترانسفورماسیون انجام شد. همچنین ارتباط کلونال سویه‌های ESBL+-E. coli و سویه‌هایی با الگوهای مقاومت دارویی یکسان در هر مرغداری با کمک روش RAPD- PCR بررسی شد. گروههای فیلوژنتیک و حضور ژن‌های مربوط به پاتوتیپ‌های روده‌ای نیز در سویه‌های ESBL مثبت با کمک روش PCR مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج: در مجموع 467 سویه اشریشیا کلی از طیور (445) و کارگران (22) بدست آمد. مقاومت به بیشتر خانواده‌های آنتی‌بیوتیکی در دومین فاز نمونه‌گیری به طور معنی‌داری افزایش یافت (p value < 0.05). حضور سویه‌های MDR (3/92%)، احتمالا XDR (2/3%) و PDR (4/0%) در جدایه‌های طیور تشخیص داده شد، همچنین فراوانی سویه‌های MDR در کارگران 7/72% تعیین گردید. رایج‌ترین الگوی MDR در سویه‌های جدا شده از طیور تتراسیکلین‌ها+ پنی‌سیلین‌ها+ فنیکل‌ها+ کوئینولون‌ها بود که در سویه‌های جدا شده از کارگران هم دیده شد. مقایسه الگوهای پلاسمیدی سویه‌های بدست آمده از مرغداری‌های متفاوت، یک الگوی مشابه را در دو مرغداری (C و D) نشان داد که محل تامین جوجه یکسانی داشتند. سویه‌های اشریشیا کلی که از فاز I یا II دوره پرورش بدست آمدند بر اساس الگوهای مقاومتی عمدتا با سویه‌هایی از همان فاز طبقه بندی شدند. فنونیپ ESBLs در 3/6% از سویه‌های طیور مشاهده شد که از هر دو فاز نمونه‌گیری بدست آمده بودند. پنج سویه (8/17%) تولید کننده CTX-M-1، دو سویه (1/7%) تولید کننده TEM-116، یک سویه تولید کننده CTX-M-61 (6/3%) و سویه دیگری تولید کننده CTX-M-1/36 (6/3%) بود. اکثریت سویه‌های ESBLs مثبت MIC ? 32 ?g/Ml را برای سفتازیدیم نشان دادند. سویه‌های اشریشیا کلی به ترتیب فیلوگروه‌های D (8/42%)، B1 (1/32%)، A (8/17%) و B2 (1/7%) را نشان دادند. یک سویه واجد ژن eae بود و به عنوان اشریشیا کلی بیماریزای روده‌ای غیر تیپیک شناسایی (Atypical EPEC) شد و دو سویه دیگر با حضور ژن‌های stx2 و hly به عنوان اشریشیا کلی تولید کننده شیگا توکسین (STEC) و سپس کشت بر روی SMAC و انجام آزمایشات سرمی به عنوان سروتیپ O157:non- H7 شناسایی شدند. آزمایش ترانسفورماسیون نشان داد که ژن‌های blaESBLs بر روی پلاسمید قرار دارند و منتقل می‌شوند. نتیجه گیری: اگرچه در این مطالعه تغییرات الگوهای MDR بین دو فاز نمونه‌گیری و بروز سویه‌های PDR برقرار بود، تشخیص سویه‌های MDR در اولین هفته دوره پرورش پیشنهاد می‌کند آلودگی هچری‌ها عامل آلودگی اولیه گله‌های مذکور می‌باشد. از طرف دیگر مشاهده الگوهای پلاسمیدی مشابه در سویه‌هایی از دو مرغداری متفاوت که محل تامین جوجه یکسان داشتند نیز بر نقش آلودگی اولیه جوجه‌ها در هچری و یا اکتساب این آلودگی از گله‌های مادر تاکید بیشتری می‌کند و بررسی هچری‌ها و گله‌های مادر گوشتی را از لحاظ وضعیت مقاومت‌های آنتی‌بیوتیکی پیشنهاد می‌کند. مطالعه حاضر بر شیوع سویه‌های MDR E. coli در جوجه‌های گوشتی و کارگران در ایران تاکید می‌کند که می‌تواند تهدیدی برای سلامت طیور و انسان باشد. این مطالعه اولین تشخیص اشریشیا کلی تولید کننده ESBLs در گله‌های طیور گوشتی سالم در ایران و اولین گزارش از حضور ژن blaTEM-116در جدایه‌های اشریشیا کلی جدا شده از طیور در سرتاسر دنیا است. حضور باکتری‌های تولید کننده ESBLs در میکروبیوتای طیور و تنوع بالای ژنتیکی این جدایه‌ها نگران کننده است و نشان می‌دهد طیور مخزنی از ژن‌ها و مقاومت‌های مذکور هستند.
- Abstract
- Background: Consumption of antibiotics in poultry results in the emergence of resistant commensal E. coli strains which acts as a threat to public health. Objective: The aim of this work was to study the changes of the antimicrobial resistance patterns, the prevalence and the diversity of ESBLs of fecal E. coli isolates at the first week after entering of chickens to the farm and the last week of rearing period before slaughtering. Methods: We analyzed samples from cloacal swabs of healthy poultry (500) and from rectal swabs of workers (25) from five different poultry houses in Tehran, Iran. Samples were plated on MacConkey agar. Bacterial identification, antibiotic susceptibility, Phenotypic Detection of ESBLs, ESBL+- E. coli plasmid extraction and profiling, PCR and DNA sequencing for identification of ESBLs and transformation assay were performed by standard procedures. Clonal relatedness of ESBL+-E. coli strains and E. coli strains with common antibiotic resistance patterns in every farm was established by RAPD- PCR. ESBL+- E. coli phylogenetic groups were identified by a multiplex PCR. Analysis of intestinal pathotypes in ESBL+- E. coli strains was accomplished by PCR. Results: A total of 467 Escherichia coli strains were obtained from broilers (445) and workers (22). Resistance to most antimicrobial families increased in the second phase, significantly. The presence of MDR (92.3%), possible XDR (3.2%) and PDR (0.4%) strains was detected among poultry isolates. The most common MDR pattern in the poultry strains was TE+PEN+PHE+FQ which also detected in the workers strains. Comparison of the plasmid patterns among the strains collected from different poultry houses showed a similar pattern in two farms which had the same supply place of chicken. The E. coli strains that were obtained from phase I or II of the rearing were mostly clustered (based on resistance patterns) with the other strains from the same sampling phase in other farms. ESBL phenotype was totally observed among 6.3% (28/445) of the poultry strains, which was obtained from both rearing phases. Five strains (17.8%) produced CTX-M-1, two strains (7.1%) produced TEM-116, and one strain produced CTX-M-61 (3.6%) and another produced CTX-M-1/36 (3.6%). The most ESBL positive strains showed minimum inhibitory concentrations (MICs) ? 32 ?g/mL for ceftazidime. Phylogenetic grouping of E. coli showed types D (42.8%), B1 (32.1%), A (17.8%), and B2 (7.1%). One strain was identified as an atypical EPEC (eae), two strains were identified as STEC (stx2 and hly) and O157: non- H7. Transformation experiment indicated that blaESBLs genes were plasmid - borne and transmissible. Conclusion: Although changes of MDR patterns between the two rearing phases and the emergence of possible PDR strains was established in this study, detection of the MDR strains at the first week of rearing proposed early contamination of noted farms in related hatcheries. The presence of similar plasmid patterns among strains from two different farms with the same chicken supply place highliths the initial contamination of chickens in the hatcheries or acquisition of contamination from breeder farms. The study of antibiotic resistances in hatcheries and breeder farms is proposed. The present study highlighted the prevalence of multiple drug resistant E. coli strains among healthy broiler chickens and workers in Iran, which could be a threat for human and poultry health. This study is the first detection of ESBL -producing E. coli strains in healthy broilers in Iran and the first report from blaTEM-116 in poultry E. coli strains in worldwide. The presence of ESBL producers in poultry microbiota and the high genetic diversity among these isolates are worrisome and indicate an established reservoir in poultry.
