عنوان پایان‌نامه
بیان گیاهی آنتیژن حفاظتی (PA) و فاکتور کشنده(Lf) با سیلوس و آنتراسیس
- رشته تحصیلی
- اصلاح نباتات - ژنتیک مولکولی و مهندسی ژنتیک
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی شماره ثبت: 7117;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 77088;کتابخانه مرکزی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی شماره ثبت: 7117;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 77088
- تاریخ دفاع
- ۰۵ اسفند ۱۳۹۴
- دانشجو
- فریبا ابوئی مهریزی
- استاد راهنما
- هوشنگ علیزاده, علیرضا عباسی
- چکیده
- چکیده عامل بیماری سیاه¬زخم، باکتری Bacillus anthracis است که سبب بروز سیاه¬زخم پوستی، گوارشی و ریوی می¬شود. واکسن¬های موجود در بازار که علیه این بیماری استفاده می¬شوند، جهت ایمنی¬زایی به چند تزریق نیاز دارند و به دلیل حضور سایر سموم باکتری در واکسن، احتمال عوارض جانبی وجود دارد. به منظور مقابله با این بیماری، تلاش زیادی با هدف تولید واکسن¬های موثرتر در سال¬های اخیر صورت گرفته ¬است. در تحقیق حاضر، از دمین چهار آنتی¬ژن حفاظتی (PA4) و دمین یک عامل کشنده (LF1) B. anthracis برای بررسی و تولید واکسن زیرواحدی ارزان قیمت، سهل الوصول، ایمن و کارا استفاده شد. اجوان باکتریایی CTB از باکتری Vibrio cholera نیز در ترکیب با آنتی¬ژن¬ها مورد استفاده قرار گرفت. برای استفاده از سیستم باکتریایی Escherichia coli، ترکیبی از آنتی¬ژن¬های مذکور و اجوان CTB در ناقل بیانی pET28a+ همسانه¬سازی و نه ترکیب مختلف سازه به سویهBL21 (DE3) منتقل شدند. در این بخش تولید پروتئین¬های نوترکیب با آزمون الایزا و وسترن بلات تایید شد. در ساخت سازه¬های بیانی گیاهی، ترکیبی از سه آنتی¬ژن (PA4 و LF1 و PA::LF)، دو نحوه اتصال آنتی¬ژن به اجوان CTB، پپتید نفوذ کننده به سلول (CPP) و همچنین سه پپتید راهنمای اکستنسین هویج، گاما زئین ذرت و کفیرین سورگوم در قالب ناقل پایه pBI121 استفاده شد. از سوی دیگر با هدف ارتقای سیستم تولید پروتئین نوترکیب، قطعه¬ای در قالب ناقل حدواسط pVUT طراحی و سنتز شد تا از خواص UTRهای ناحیه?3 و?5 ویروس CPMV در افزایش تولید پروتئین استفاده شود، در این بخش ترکیب سازه¬ها در قالب ناقل pCAMBIA 1304 آماده و از ژن 2b به عنوان بازدارنده سیستم خاموشی ژن در گیاه استفاده شد. برای بررسی عملکرد پپتیدهای راهنما، ترکیب¬های مختلف سازه حاوی ژن گزارشگر بتاگلوکورونیداز ساخته و بیان موقت آنها در کاهو و توتون از طریق سنجش کیفی GUS بررسی شد. از بین سازه¬های گیاهی ساخته شده در ناقل pBI121، هشت سازه برای انتقال ژن در توتون مورد استفاده قرار گرفت. تعدادی از لاین¬های تراریخته حاصل در نسل یک با استفاده از PCR، qPCR و آزمون الایزا تایید شدند. همچنین بیان موقت دو سازه حاوی آنتی¬ژنPA::LF و CTB و پپتید راهنمای اکستنسین در ناقل pCAMBIA 1304 با کمک اگروباکتریوم سویه C58 و بیان موقت پنج سازه حاوی آنتی¬ژن PA::LF و CTB با پپتید راهنمای اکستنسین در ناقل pCAMBIA 1304 و pBI121 با کمک اگروباکتریوم سویه LBA4404 در توتون رقم سامسون و کاهوی تجاری انجام و از طریق qPCR و الایزا تایید شد. طبق نتایج حاصل از این بخش، پپتید راهنمای زرا کارایی بیشتری در حفظ پروتئین نوترکیب و کمک به افزایش تجمع پروتئین نشان داد. همچنین مقایسه سازههای مورد استفاده در این بررسی تاثیر عوامل تشدید کننده ترجمه ) UTR ( را تایید کرد. کلمات کلیدی؛ سیاه زخم، انتقال ژن، اگرواینفیلتراسیون، آزمون الایزا، وسترن بلات
- Abstract
- A pathogenesis factor named Bacillus anthracis causes anthrax lead to the clinical patterns including cutaneous anthrax, gastrointestinal anthrax and inhalational anthrax. Conventional vaccines against anthrax need to several injections to be immunologically effective and of course there is possibility of side effect originate from some bacterial toxins present in this kind of vaccine. In recent years much efforts has directed to produce more effective vaccines against the disease. In this research protective antigen domain 4 (PA4) and lethal factor domain 1 (LF1) of B. anthracis were used to get an economically suitable subunit vaccine that is readily available, safe and more effective than conventional vaccines. Bacterial adjuvant CTB was used in combination with the antigens. Different composition of the antigens and CTB inserted into the pET28a+ vector in order to use bacterial system of Escherichia coli to produce recombinant proteins. In this part, nine constructs prepared and transformed into the Bl21 (DE3) and production of recombinant proteins confiemed through ELISA assay and western blotting. In plant constructs, apart from adjuvant and antigens, other elements like Extensin signal peptide from carrot, ?-zein from maize and ?-kafirin from sorghum were used to make constructs based on pBI121 binary vector. To promote protein expression in plants a synthesized segment including 3’UTR and 5’mUTR of CPMV was employed in the intermediate pVUT vector. In this part different constructs were insterted into the pCAMBIA 1304 binary vector and 2b gene was used as an RNAi inhibitor. In addition, series of constructs harbouring reporter gene beta-glucuronidase (GUS) made to compare three signal peptides and GUS transient expression analysed in tobacco and lettuce. In the other part of the work, eight pBI121-based constructs were employed to transform tobacco. Some of T1 plants verified by PCR, qPCR and ELISA test. Transient expression of two constructs harbouring PA::LF, CTB and Extensin signal peptide based on pCAMBIA 1304 binary vector agroinfiltrated by agrobacterium tumefaciens strain C58 and also five constructs harbouring PA::LF, CTB and Extensin signal peptide based on pCAMBIA 1304 and pBI121 binary vectors agroinfiltrated by strain LBA4404. Subsequently transient expression of tobacco and lettuce analyzed by qPCR and ELISA test. According to the results, Zera signal petide is more effective to keep and increase production of recombinant proteins and comparison of different constructs confirmed UTRs as translational enhancers. Keywords; Anthrax, Gene transfer, Agroinfiltration, ELISA assay, Western blotting
