عنوان پایان‌نامه
بررسی پاسخ های مولکولی و فیزیولوژیکی برخی ژنوتیپ های حساس و مقاوم گندم تحت اثر قارچ بیماری زای Graminearum Fusarium و مطالعه امکان القای مقاومت در گیاه با کاربرد خارجی سالیسیلیک اسید
- رشته تحصیلی
- زیست شناسی-علوم گیاهی- فیزیولوژی گیاهی
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه پردیس علوم شماره ثبت: 5851;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 71646;کتابخانه پردیس علوم شماره ثبت: 5851;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 71646
- تاریخ دفاع
- ۱۵ مهر ۱۳۹۴
- دانشجو
- منا صراحی نوبر
- استاد راهنما
- وحید نیکنام
- چکیده
- سوختگی فوزاریومی سنبله یکی از مهمترین بیماریهای گندم و سایر غلات دانهریز در مناطق مرطوب و نیمه مرطوب جهان به شمار می رود. گونه-های مختلفی از قارچ فوزاریوم در ایجاد این بیماری نقش دارند که Fusarium graminearum از مهمترین گونههای آن است. این قارچ قادر به تولید مایکوتوکسینهایی از قبیل داکسی نیوالنول است که برای مصرف انسان و دام مضر میباشد. این بیماری در ایران یکی از مهمترین بیماریهای گندم در استان های مازندران و گرگان و منطقه دشت مغان میباشد. هدف این رساله بررسی پاسخ های فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و مولکولی یک رقم حساس (فلات) و یک رقم مقاوم (سومایتری) گندم به تنش زیستی آلودگی فوزاریومی سنبله و مطالعه سازوکارهای مقاومت رقم مقاوم و دلایل حساسیت رقم حساس به این تنش زیستی بوده است. شناسایی سازوکارهای مولکولی و عوامل بیوشیمیایی مؤثر در القای مقاومت به بیماری فوزاریوم سوختگی سنبله می تواند دریچه های جدیدی را بر روی مهندسین ژنتیک و اصلاحکنندگان نژاد برای بازسازی ویژگی های فیزیولوژیک در ارقام حساس گندم بگشاید. نتایج بهدستآمده نشان داده است که پس از آلودگی محتوای سالیسیلیک اسید، کالوز و ترکیبات فنلی و فعالیت پراکسیداز، فنیل آلانین آمونیالیاز و پلی فنل اکسیداز در رقم مقاوم نسبت به رقم حساس بالاتر میباشد. علاوه بر آن، بررسی نیم رخ بیان چندین ژن دخیل در پاسخهای دفاعی گیاه علیه بیماریزا در هر دو رقم موردمطالعه در زمانهای مختلف بعد از تلقیح بیماری با استفاده از تکنیک Real Time PCR صورت گرفت. نتایج بهدستآمده حاکی از القای سریعتر و بیشتر ژنهای فنیل آلانین آمونیالیاز، گلوکاناز و کیتیناز در رقم مقاوم نسبت به رقم حساس تحت آلودگی فوزاریوم میباشد. بر طبق نتایج بهدستآمده در این پژوهش آبیاری گیاهان با سالیسیلیک اسید، یک روز قبل از تلقیح بیماری بهطور مؤثری بیماری را در رقم فلات (به میزان5/67%) و در سومایتری (به میزان 23 /10%) کاهش داد. همچنین گیاهان تیمار شده با سالیسیلیک اسید افزایش معنیداری را در تولید H2O2، MDA، محتوای سالیسیلیک اسید و کالوز نشان دادند. به نظر میرسد سطوح افزایشیافته H2O2 توسط سالیسیلیک اسید در ارتباط با افزایش فعالیت سوپراکسید دیسموتاز و کاهش فعالیت کاتالاز باشد. علاوه بر آن، بررسی بیان ژنها نشان داده است که سالیسیلیک اسید بیان ژنها را در رقم حساس فلات بهگونهای تغییر میدهد که پاسخی شبیه رقم مقاوم نشان دهد. بهطورکلی سالیسیلیک اسید دفاع گیاه گندم در برابر بیماری فوزاریومی سنبله را بهوسیله القای بیان ژن های CYP(Cytochrome P450 monooxygenase)، PDR-5 (PDR-like ABC transporter) ، Glu-2 (beta-1,3-Glucanase)، PAL (Phenylalanine ammonia lyase) و CHI-4 (Chitinase) و همچنین القای بیان برخی پروتئینهای درگیر در متابولیسم کربن، فتوسنتزی و پاسخهای دفاعی افزایش میدهد. همچنین، الگوی بیان پروتئینی سنبلههای آلوده به قارچ و سنبلههای شاهد هر دو رقم موردمطالعه توسط ژل الکتروفورز دوبعدی موردبررسی قرار گرفتند. بهطورکلی 30 لکه پروتئینی افتراقی استانداردشده در سنبلههای تحت تیمار با قارچ و سنبلههای شاهد از طریق طیفسنجی جرمی MOLDI-TOF TOF MS شناسایی شدند. بر اساس نتایج بهدستآمده، بیشتر پروتئینهای شناساییشده مربوط به متابولیسم کربن، فتوسنتز و دفاع گیاه بودند.برخلاف فوزاریوم سوختگی سنبله، به موضوع کنترل فوزاریوم سوختگی دانهرست توجه کمتری شده است که دلیل آن اهمیت بالای آلودگی بذرها به مایکوتوکسین های تولیدشده توسط این قارچ در سنبله می باشد. در مطالعه حاضر از پرایمینگ بذرها با سالیسیلیک اسید بهمنظور کنترل بیماری استفاده شد؛ که نتایج حاکی از مؤثر بودن این تیمار در بهبود علائم ناشی از این بیماری در هر دو رقم موردمطالعه است.مطالعه و بررسی پاسخهای دفاعی گیاه به تغییرات متابولیتی بیماری زا در طی آلودگی، به دلیل تداخلات متابولیت های گیاه و بیماری زا در اثر نفوذ ریسه های قارچ به درونیاختههای گیاهی در مراحل بیماری زایی مشکل می باشد. برای رفع چنین مشکلی یکی از راهها استفاده از عصاره پاتوژن است که شامل همه ترکیبات مربوط با آن می باشد. مطالعه رشد و نمو گیاه در پاسخ به عصاره حاصل از بیماریزا و ارتباط آن با مقاومت میتواند جنبههای نا معلوم سمیت متابولیت های بیماریزا را آشکار کند. در این مطالعه اثر عصاره قارچ فوزاریوم بر دو رقم گندم در هر دو مرحله دانه رستی و گردهافشانی موردبررسی قرار گرفت. نتایج بهدستآمده نشان دهنده عدم ارتباط بین تحمل عصاره در دانه رست و سنبله است. بر طبق نتایج رقم سومایتری برخلاف مقاومت به فوزاریوم سوختگی سنبله و توان تحمل عصاره در مرحله گرده افشانی به فوزاریوم سوختگی دانه رست و عصاره حاصل از فوزاریوم در مرحله دانه رستی حساس می باشد. رقم فلات به فوزاریوم سوختگی سنبله و دانهرست و همچنین عصاره فوزاریوم در مرحله گردهافشانی حساس می باشد درحالیکه در مرحله دانه رستی تحمل بیشتری نسبت به عصاره حاصل از فوزاریوم نشان داد. بنابراین میتوان نتیجه گرفت ارتباطی میان مقاومت گندم به فوزاریوم سوختگی سنبله و دانهرست و همچنین عصاره حاصل از آن در مرحله دانه رستی وجود ندارد. که این مسئله وابستگی مقاومت را به نمو نشان میدهد. نتایج همچنین نشان داد متابولیتهای حاصل از قارچ می تواند متابولیسم گیاه و تولید انواع فعال اکسیژن را متأثر نماید. علاوه بر آن پاسخهای مولکولی و فیزیولوژیکی متفاوتی بین دو رقم فلات و سومایتری در پاسخ به عصاره قارچی مشاهده شد. القای زیمایهها و ترکیبات پاداکسایشی در رقم فلات منجر به کنترل انواع فعال اکسیژن ایجادشده تحت تیمار با عصاره شدند. رقم فلات همچنین از استراتژی نامعلومی از بلوکه شدن زیست آمایی پروتئین بهوسیله مایکوتوکسینهای موجود در عصاره در مرحله دانه رستی استفاده کرد.
- Abstract
- Fusarium head blight is a disease of cereal crops caused by a group of trichothecene producing Fusarium species such as Fusarium graminearum. It is the main disease of wheat in different areas of Iran, such as Mazandaran, Gorgan and Moghan regions. The pathogen produces mycotoxins such as deoxynivalenol (DON) that are harmful to both human and animal’s consumption. Currently, the mechanisms underlying resistance to Fusarium-caused disease are largely unknown. In the present study, we employed a combined physiological, molecular and proteomic approach to investigate responses of two wheat genotypes with contrasting levels of resistance and susceptibility to F.graminearum infection: an Iranian spring wheat cultivar, Falat, as a highly susceptible cultivar to FHB and a Chinese originated FHB resistant cultivar, Sumai3. Identification of molecular mechanisms and effective biochemical factors which are involved in defense reactions of FHB resistance in response to disease infection can open windows for biotechnologists and plants breeders to reconstruct associated physiological traits in susceptible cultivars. F.graminearum infection resulted in a greater induction level and activity of salicylic acid (SA), callose, phenolic compounds, peroxidase, phenylalanine ammonia lyase (PAL), and polyphenol oxidase in resistant vs. susceptible cultivars at 4 days after spikelet inoculation. Moreover, the time-course expression profiles of a selected set of genes that are critical to the plant’s resistance and defense reactions were compared between Sumai3 and Falat. Results determined earlier and greater induction of PAL, Glu-2 and CHI in resistant cultivar (Sumi3) as compared to susceptible cultivar (Falat) in response to F. graminearum inoculation. Soil drench application of salicylate one day before pathogen inoculation drastically curtails pathogen infection in Falat by 67.5 % and Sumai3 by 10.23%. SA treated plants showed a significant increment in hydrogen peroxide (H2O2) production, lipid peroxidation, SA and callose content. SA- induced H2O2 level seems to be related with increase of superoxide dismutase and decrease of catalase activities. In addition, real-time quantitative PCR analysis showed that salicylate treatment elicited genes expression in susceptible cultivar to show a similar pattern as resistant when inoculated with F.graminearum. Salicylic acid improved wheat defense against F.graminearum infection by up-regulation of CYP (Cytochrome P450 monooxygenase), PDR-5 (PDR-like ABC transporter),Glu-2 (beta-1,3-Glucanase),PAL (Phenylalanine ammonia lyase) and CHI-4 (Chitinase) genes and some proteins which are involved in carbon metabolism, photosynthesis and stress defense of plants.Two-dimensional electrophoresis display of proteins extracted from spikelets of susceptible and resistant wheat infected with F.graminearum were compared with those from inoculated with mock, treated with SA as well as treated with SA plus F.graminearum. In total, 30 protein spots were detected to be differentially regulated due to F.graminearum infection and were analyzed with MALDI- TOF TOF MS for identification. Many of the proteins identified are related to carbon metabolism, photosynthesis and stress defense of plants. Control of seedling blight has received less attention than control of FHB because of the higher risk associated with mycotoxin contamination of grain in FHB. So far, the main approaches for controlling Fusarium seedling blight are seed treatment with fungicides or biocontrol agents. Hence in this study, the effect of seed priming with salicylic acid priming on FSB incidence and severity was investigated. According to our results seed priming with SA improved wheat defense against FSB in both cultivars. Tracking plant defense responses to pathogen metabolic changes during infection is difficult because of difficulty of separating pathogen/ plant metabolic involvements as a result of pathogen hyphae penetration into plant cells in the final pathogenesis stages. To tackle this problem, one can use crude extract of pathogen, which contains all pathogen compounds to resemble the condition of living pathogen at its aggressive phase. Here, we investigated the effect of F.graminearum crude extract on two wheat genotypes at germination, seedling and anthesis stages to elucidate their effect on wheat growth and development, the mode of action and respective defensive response. Our results revealed that there is no relationship between wheat seedling and spike tolerance to F. graminearum crude extract. According to our results Sumai3 in spite of its resistance to FHB and crude extract at anthesis was susceptible to seedling blight and sensitive to crude extract at germination. Falat showed susceptibility to FHB, FSB and sensitivity to crude extract at anthesis and seedling stage but it was more tolerant to crude extract than Sumai3 in germination. Apparently there was no association between wheat resistance to FHB, FSB and F.graminearum crude extract in germination stage. This shows a dependency between resistance and development. We also observed that pathogen metabolites could affect plant metabolism and ROS production. Moreover, we observed substantial differences in physiological and molecular responses between Falat and Sumai3 in response to F.graminearum crude extract. A set of antioxidative enzymes and antioxidant compounds was activated in Falat which can control reactive oxygen species. Falat also employs an unknown strategy to prevent blocking protein biosynthesis by mycotoxins.
