عنوان پایان‌نامه
بررسی نقش دومین های BIR۲ و BIR۳ برای رها سازی مینی آپوپتوزوم از مهار XIAP توسط پپتید و پروتئین SMAC
- رشته تحصیلی
- بیوشیمی
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک شماره ثبت: 11643ب
- تاریخ دفاع
- ۱۸ تیر ۱۳۹۶
- دانشجو
- فائزه عطاران بندر آبادی
- استاد راهنما
- جمشید داودی
- چکیده
- کاسپاز-9 به‌عنوان آغازگر مسیر میتوکندریایی اپاپتوز با دایمر شدن از طریق ارتباط با هپتامرهای Apaf-1 و تشکیل کمپلکس اپاپتوزوم فعال می‌شود. کمپلکس حاصل از کاسپاز-9 و Apaf-1 فاقد بخش تنظیمی، "مینی اپاپتوزوم" نام دارد که فعالیتی مشابه اپاپتوزوم از خود نشان می‌دهد و در این طرح از آن استفاده و به‌اختصار، اپاپتوزوم خوانده‌شده است. پروتئین XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein) از طریق دمین BIR3 به‌طور مستقیم به کاسپاز-9 متصل شده و آن را مهار می‌کند. Smac بر سر اتصال به XIAP با کاسپاز-9 رقابت کرده و اثر مهاری XIAP را از روی اپاپتوزوم برمی‌دارد. در این پژوهش اثر حضور دمین BIR2 XIAP در فعالیت آنتاگونیستی Smac موردمطالعه قرار گرفت. نتایج حاصل نشان داد که حضور BIR2 بر فعالیت مهاری XIAP روی اپاپتوزوم اثری ندارد اما اثر آنتاگونیستی Smac بر فعالیت XIAP را افزایش می¬دهد. ازآنجاکه در بسیاری از سلول‌های سرطانی نسبت پروتئین XIAP به پروتئین Smac افزایش نشان می‌دهد، مولکول‌هایی که فعالیت Smac را تقلید می‌کنند در طراحی داروهای ضد سرطان موردتوجه قرارگرفته‌اند که اساس این داروها پپتید انتهای آمین Smac (موتیف AVPI) می‌باشد. در این پژوهش اثر توالی انتهای آمین Smac بر مهار اپاپتوزوم مطالعه شد تا مشخص شود حضور این موتیف به‌طور مجزا می‌تواند به‌طور کارآمد از مهار اپاپتوزوم جلوگیری کند یا خیر. مقایسه‌ی عملکرد پپتید سنتز شده‌ی Smac، با توالیAVPIVASLPN، با پروتئین Smac نشان داد که ماهیت دایمر این پروتئین و نیز حضور بخش‌های دیگر پروتئین، به‌جز موتیف متصل شونده به IAP ها یا همان AVPI، موجب کارآمدی فعالیت آن می‌گردد. در بخش دیگر مطالعات به بررسی بیشتر فعالیت اپاپتوزوم پرداخته شد. مقایسه‌ی فعالیت اپاپتوزوم در حضور غلظت‌های کم‌وزیاد Apaf-1 نشان داد که اپاپتوزوم در حضور غلظت کمتر Apaf-1 فعالیت بیشتری نشان می‌دهد و درنتیجه تمایل مولکول‌های کاسپاز-9 به Apaf-1 بیشتر از تمایل آن‌ها به آنزیم‌های متصل به اپاپتوزوم است. همچنین مقایسه‌ی فعالیت اپاپتوزوم متشکل از کاسپاز-9 یا پروکاسپاز-9 نشان داد که کاسپاز-9 فعال‌تر از پروکاسپاز-9 بوده و این به دلیل بیشتر بودن فعالیت کاتالیتیک کاسپاز-9 است. با توجه به تبدیل تدریجی پروکاسپاز-9 به کاسپاز-9 در سلول اپاپتوزی به مطالعه‌ی فعالیت مخلوط این دو آنزیم پرداخته و
- Abstract
- Caspase-9, an initiator caspase, is activated through dimerization facilitated by the heptameric Apaf-1. The complex is known as apoptosome. A shorter version of Apaf-1 (residues 1-591) was used in this project to activate caspase-9 which is called mini-apoptosome. The mini-apoptosome has the same properties as the apoptosome with respect to caspase-9 activation. X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) directly binds to caspase-9 via BIR3 domain and inhibits its activity. Smac removes XIAP inhibition of caspase-9 competing with it for binding to BIR3. We investigated the role of BIR2 domain in antagonistic effects of Smac. The results showed that BIR2 has no contribution in caspase-9 inhibition but increases the ability of Smac to remove caspase-9 inhibition by XIAP in the apoptosome. Since the expression ratio of XIAP to Smac is increased in many cancer cell types, Smac mimetics, designed based on AVPI motif, may potentiate apoptosis in cancer cells. We studied the antagonistic effect of seperate AVPI motif, a peptide designed based on N-terminus of processed Smac which starts with AVPI, in comparison to natural bivalent Smac. Our results indicate that the Smac protein prevents XIAP mediated apoptosome inhibition more potently than the Smac peptide. This is a result of bivalent nature of Smac as same as the protein moiety other than AVPI. We also studied the apoptosome activity and showed that caspase-9 is more active at lower concentration of Apaf-1 as compared to its higher concentration suggesting that caspase-9 has more affinity to Apaf-1 than to the apoptosome bound enzyme. Additionally, caspase-9 was more active than pro-caspase-9 as a result of its better catalytic activity. In an apoptotic cell, pro-caspase-9 is converted to caspase-9. We showed that this causes to increase the activity of apoptosome. Furthermore, presence of caspase-9 and procaspase-9 simultaneously led to higher enzymatic activity than expected suggesting a certain level of cooper
