عنوان پایان‌نامه
مطالعه چندشکلی، ساختار، بیان نسبی و عملکرد ژنهای کلیدی مسیر بیوسنتز کانابینوییدها در شاهدانه Cannabis sativa L
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی شماره ثبت: 7538;کتابخانه مرکزی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی شماره ثبت: 7538
- تاریخ دفاع
- ۲۹ شهریور ۱۳۹۶
- دانشجو
- طاهره برنا
- استاد راهنما
- سیدعلیرضا سلامی, مجید شکرپور
- چکیده
- گیاه شاهدانه (Cannabis sativa L.) دارای تاریخچه طولانی کشت و کار برای مصارف متنوع شامل غذا، فیبر و دارو است. همچنین تولید داروهای مخدر از شاهدانه با میزان تتراهیدروکانابینول (THC) بالا (نوع دارویی) برای اهداف تسکینی در بیشتر کشورها غیرقانونی و تحت کنترل شدید است. در مقابل کشت گیاهانی با میزان THC پایین (نوع فیبری) در بسیاری از کشورها توسعه یافته است. نسبت THC و کانابیدیول (CBD) نشانگر مناسبی برای تمایز تیپ دارویی و فیبری شاهدانه است. تفکیک تیپ های دارویی و غیر دارویی شاهدانه از لحاظ مورفولوژیک و سنجش شیمیایی در مراحل رویشی اولیه دشوار است. از این رو توانایی تعیین خصوصیات فنوتیپ شیمیایی بطور صحیح برای توسعه ارقام اختصاصی تولید بذر، فیبر و دارو اهمیت دارد. در این مطالعه، از یکی از روش های سریع و حساس غربال گری به نام آنالیز منحنی ذوب با وضوح بالا برای شناسایی سریع واریانت های توالی DNA و به منظور تمایز تیپ های دارویی و فیبری شاهدانه استفاده شد. روش خاموش سازی ژن به واسطه ویروس (VIGS) برای بررسی عملکرد ژن THCAS در گیاه شاهدانه با استفاده از سیستم ناقلTRV مورد بررسی قرار گرفت. استفاده از این روش در درک عملکرد ژن بوسیله خاموش سازی ژن بیوسنتز کننده THC شرح داده شده است. همچنین در این مطالعه، آنالیز کمی بیان ژن به کمک Real-Time PCR بر روی RNA 14 جمعیت ایرانی منتخب انجام شد تا ارتباط بین غلظت THC و CBD و بیان ژن های THCAS و CBDAS بررسی گردد. هیچ ارتباط مشهودی بین سطح رونویسی ژن THCAS و نسبت THC تجمع یافته در گل آذین وجود نداشت. داده های بیان ژن تایید کرد که تبدیل کانابی ژرولیک اسید (CBGA) به تتراهیدروکانابینولیک اسید (THCA) و کانابیدیولیک اسید (CBDA) در بیشتر موارد به لحاظ رونویسی تنظیم نمی شود. برای موفقیت در حوزه مهندسی متابولیک، داشتن درک درستی از نحوه بیان ژن ها و تنظیم آنها ضروری است. از این رو جداسازی و شناسایی پروموترها در شناختن این عوامل تنظیمی و فاکتورهای دخیل در رونویسی راه گشا خواهد بود. با توجه به اهمیت عناصر عمل کننده سیس قرار گرفته در ناحیه پروموتری، لازم است تا موتیف های عملکردی پاسخ دهنده به الیسیتورهای خاص برای تنظیم بیان ژن شناسایی و تعیین خصوصیت شوند. هیچ گونه اطلاعاتی در مورد نواحی تنظیمی ژن های کلیدی مسیر بیوسنتزی این گیاه وجود ندارد. در این مطالعه، در حدود bp2000 از ناحیه پروموتری ژن THCAS با استفاده از روش TAIL-PCR شناسایی شد. آنالیز بعدی با استفاده از پایگاه های اطلاعاتی نظیر PlantCARE و PlantPan، موتیف های عملکردی پاسخ دهنده به تنش های زیستی و غیر زیستی را مشخص نمود. بسیاری از عناصر فعال پروموتر شناسایی شده، موتیف های درگیر در پاسخ به محرک های نوری، همچنین جعبه W (W-Box)، محل اتصال فاکتورهای رونویسی WRKY، جعبه های TATA و CAAT در این توالی شناسایی شد. این نتایج می تواند در درک تنظیم بیوسنتز THCA مفید باشد و مهندسی متابولیک اختصاصی تریکوم این ترکیب را تسهیل می نماید.
- Abstract
- Cannabis sativa L. has a long history of cultivation as a multipurpose plant for food, fiber, medicine and recreational drugs. Production of high tetrahydrocannabinol (THC) plants for narcotic use (drug-type) is illegal and under control in most countries. In contrast, cultivation of low THC plants (fiber-type, also known as ‘industrial hemp’) is promoted in many countries. The determination of C. sativa L. chemotypes is based on the major cannabinoids content, THC, cannabidiol (CBD) and cannabinol (CBN). The THC:CBD content ratio is a candidate marker for differentiation of the fiber and drug type of cannabis. The ability to accurately characterize the cannabinoid chemical phenotype (chemotype) is crucial for the development of specific C. sativa cultivars for pharmacological, hemp fiber or seed end-use. High resolution melting (HRM) curve analysis is used as a rapid and effective mechanism for detection of single nucleotide polymorphisms in plants. In this report, we developed a HRM protocol for differentiation of drug and non-drug cannabis plants. According to the results, HRM analysis based on single nucleotide polymorphisms in THCAS is an accurate method to differentiate the drug type of cannabis. Also to investigate the THCAS gene as one of the most important genes in cannabinoid pathway, more in detail, the VIGS strategy was used. The bipartite pTRV vector system is a Tobacco Rattle Virus-based virus-induced gene silencing (VIGS) platform that has provided efficient and effective means to assay gene function in diverse plant systems. A VIGS method was developed herein to investigate gene function in C. sativa plants using the pTRV vector system. The utility of this approach in understanding gene function is demonstrated by silencing known THC biosynthetic gene. Also, in this study, we describe analyses performed by Real-Time Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction (Real-Time RT-PCR) on RNA of 14 accessions of Iranian Cannabis population, carried out to investigate a correlation between tetrahydrocannabinol (THC) concentration in Cannabis and the tetrahydrocannabinol acid synthase (THCAS) gene expression. There was no apparent correlation between the level of transcription of the THCA-synthase gene(s) and the proportion of THC actually accumulated in the inflorescences. Overall, these gene expression data confirm that the conversion of CBGA in THCA and CBDA is not transcriptionally regulated in most cases. In metabolic engineering approach, isolation and characterization of promoters leads to an understanding of which cis-acting elements are responsible for the regulation of gene expression. THCAS is a key enzyme in Cannabinoids biosynthetic pathway. In order to allow chromosome walking beyond the 5'-flanking region of THCAS, 2000 bp upstream of THCAS start codon was isolated. The subsequent sequence analysis using bioinformatics softwares revealed that there were several cisacting elements such as TATA-box, CAAT-box, and GA-responsive element, and several W-box and light-responsive elements inside the THCAS promoter. These results can be helpful in understanding of THCA biosynthesis regulation and will facilitate trichome-specific metabolic engineering of the compound.
