عنوان پایان‌نامه
افزایش بیان پروتئین GRP۷۸/BIPدر سلولهای پوششی رنگدانه دار شبکیه انسان و بررسی تاثیر آن بر شبکه پیامرسانی پاسخ به پروتئین های تانخورده (UPR)
- رشته تحصیلی
- بیوشیمی
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 81894;کتابخانه مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک شماره ثبت: 11644ب;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 81894;کتابخانه مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک شماره ثبت: 11644ب
- تاریخ دفاع
- ۰۶ شهریور ۱۳۹۶
- دانشجو
- شیما قادری
- استاد راهنما
- شهین احمدیان
- چکیده
- چکیده یافته های اخیر نشان می دهند انتقال ژن Grp78 بواسطه ویروس وابسته به آدنو (AAV) به گیرنده های نوری چشم، موجب کاهش استرس شبکه اندوپلاسمی (ER) شده و مانع مرگ سلولها در مدلهای موشی رتینیت پیگمنتوزا (RP) می شود. در پژوهش حاضر، بیان ژن Grp78 در کشت سلولهای پوششی رنگدانه دار شبکیه انسان(hRPE) ، به کمک ویروس AAV افزایش داده شد، و تاثیر آن بر پاسخ سازشی سلولها نسبت به استرس ER مطالعه گردید. هدف از انجام این پژوهش، مطالعه اثر بیش بیان پروتئین GRP78 بر بقای سلولهای RPE تحت استرس ER، به عنوان مدل in vitro بیماریهای تخریبی RPE بوده است. بدین منظور، سلولهای RPE از کره چشم اجساد انسانی جداشده، کشت داده شدند و هویت آنها به روش ایمونوسیتوشیمی تایید شد. سپس وکتورهای ویروسی نوترکیب (rAAV/Grp78) در سلولهای تولیدکننده ویروس (HEK293T) تولید شدند. به منظور تایید بیش بیان Grp78، سلولهای RPE توسط ویروسهای نوترکیب اینفکت شده، و سپس بیان Grp78 در نقاط زمانی گوناگون به کمک تکنیک real-time PCR و وسترن بلاتینگ اندازه گیری شد. جهت تعیین اثر بیش بیان Grp78 بر شبکه پیامرسانی پاسخ به پروتئینهای تانخورده (UPR)، سلولها توسط ویروسهای نوترکیب اینفکت شده و تحت تیمار داروی القاکننده استرس ER (تونیکامایسین) قرار گرفتند. در پایان، تغییرات بیانی چهار نشانگر مهم UPR در سطح رونویسی و ترجمه بررسی گردید. نتایج آزمایشات نشان دادند بیش بیان پروتئین GRP78، تاثیر قابل توجهی در تنظیم نشانگرهای پاسخ UPR به نفع مسیرهای سازشی و بقای سلولی در سلولهای RPE انسانی دارد. در واقع، افزایش بیان GRP78، بواسطه افزایش بیان تنظیم کننده های اصلی UPR (PERK and ATF6?) و کاهش بیان پروتئین کلیدی پیش آپوپتوزی (GADD153/CHOP)، می تواند موجب تقویت فاز سازشی و تخفیف فاز آپوپتوز در سلولهای RPE تحت استرس شبکه اندوپلاسمی گردد. در مجموع به نظر می رسد فاکتور بقای سلولی GRP78 با عملکرد ضدآپوپتوزی در مراحل اولیه پاسخ UPR، می تواند یک کاندیدای ارزشمند برای تحقیقات درمانی بیماریهای تخریبی RPE در نظر گرفته شود. کلید واژه: سلولهای پوششی رنگدانه دار شبکیه، ویروس وابسته به آدنو، استرس شبکه اندوپلاسمی، شبکه پیامرسانی پاسخ به پروتئینهای تانخورده، تونیکامایسین، GRP78
- Abstract
- Purpose: Adeno associated virus (AAV)-mediated gene delivery of GRP78 (78kDa glucose-regulated protein) attenuates the condition of endoplasmic reticulum (ER) stress and prevents apoptotic loss of photoreceptors in retinitis pigmentosa (RP) rats. In the current study we overexpressed Grp78 with the help of AAV-2 in primary human retinal pigmented epithelium (hRPE) cell cultures and examined its effect on cell response to ER stress. The purpose of this work was to study the potential stimulating effect of GRP78 on adaptation/pro-survival of hRPE cells under ER stress, as an in vitro model for RPE degeneration. Methods: To investigate the effect of Grp78 overexpression on unfolded protein response (UPR) markers under ER stress, hRPE primary cultures were transduced by recombinant virus rAAV/Grp78, and treated with ER stressor drug, Tunicamycin. Expression changes of four UPR markers including GRP78, PERK, ATF6? and GADD153/CHOP, were assessed by real-time PCR and western blotting. Results: We found that GRP78 has a great contribution in modulation of UPR markers to favor adaptive response in ER-stressed hRPE cells. In fact, GRP78 overexpression affected adaptation and apoptotic phases of early UPR, through enhancement of two master regulators/ER stress sensors (PERK and ATF6?) and down-regulation of a key pro-apoptotic cascade activator (GADD153/CHOP). Conclusion: Together these findings demonstrate the promoting effect of GRP78 on adaptation/pro-survival of hRPE cells under ER stress. This protein with anti-apoptotic properties in the early UPR and important role in cell fate regulation, can be recruited as a useful candidate for future investigations of RPE degenerative diseases
