عنوان پایان‌نامه
ارزیابی انتی بادیN۱
- رشته تحصیلی
- بیو تکنولوژی
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه دانشکده دامپزشکی شماره ثبت: 476 ت;کتابخانه دانشکده دامپزشکی - مخزن مرد آباد شماره ثبت: 476 ت;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 55470
- تاریخ دفاع
- ۱۶ اسفند ۱۳۹۰
- دانشجو
- رامین سلیمانی
- استاد راهنما
- مهدی وصفی مرندی
- چکیده
- آنفلوانزای طیور، بیماری ویروسی واگیری است که سلامت انسان ها و نیز صنعت طیور را تحت تاثیر قرار می دهد. واکسیناسیون بعنوان یک ابزار کنترل جهت ریشه کنی آنفلوانزای طیور می باشد. ولیکن منجر به محدودیت هایی شامل ممنوعیت های تجاری و تداخل در آزمایشات سرولوژیکی جهت تمایز میان حیوانات آلوده و واکسینه می شود. بنابراین استفاده از روش های سرولوژیکی مطمئن و حساس جهت تشخیص سریع بیماری آنفلوانزا تحت تیپ H9N2 ضروری و از اهمیت خاصی برخوردار است. هدف اصلی تحقیقات حاضر، بیان پروتئین NS1 ویروس آنفلوانزای Low Pathogenic Avian Influenza جهت استفاده در بررسی مبتنی بر NS1، به منظور تمایز طیور واکسینه از طیور آلوده در فیلد می باشد. چندین استراتژی DIVA جهت غلبه بر این محدودیت ها ارائه شده اند. در این مطالعه توالی کامل و نیز بخشی از توالی دومن یک و دو پروتئین NS1 تحت تیپ H9N2 ویروس آنفلوانزای طیور از طریق PCR تکثیر شدند. بعد از استخراج و تخلیص توالی های NS1 از روی ژل آگاروز، توالی کامل ژن NS1 و هر یک از توالی های کوتاه شد? دومن های NS1 به ترتیب در پلاسمید هایpMAL-c2X و pGEX-4T-1 کلون گردیده، سپس با استفاده از روش الکتروپوراسیون در سلول اشریشیاکلی سویه DH5? ترانسفورم گردیدند. کلونی های ای کولای واجد ژن NS1 نوترکیب با استفاده از PCR، restriction mapping analysis و sequencing مورد بررسی قرار گرفتند. سپس پروتئین های NS1 نوترکیب بیان گردیده و با استفاده از روش کروماتوگرافی جذبی براساس پروتئین فوزیون های MBP، GST و نیز 6xHis خالص شدند. وزن ملکولی پروتئین MBP-NS1 بر روی ژل SDS-PAGE، یک باند 68 کیلو دالتونی را نشان داده در حالیکه هر دو پروتئین کوتاه شده GST-NS1 باند پروتئینی حدود 31 کیلودالتون را نشان داده اند. آنالیز وسترن بلات تنها با توالی کامل پروتئین NS1 با استفاده از سرم های بدست آمده ازمرغ های واکسینه،challenged وآلوده فیلدی با تحت تیپH9N2 نتایج مورد انتظاررا در بر داشت. بیشتر سرم های تهیه شده از مرغ های واکسینه شده، در آنالیز وسترن بلات واکنش منفی نشان دادند. الیزای غیر مستقیم جهت ارزیابی آنتی بادی های خاص پروتئین NS1 تحت تیپ H9N2، بطور موفقیت آمیزی با استفاده از پروتئین نوترکیب NS1 بعنوان آنتی ژن (که می تواند بطور سرولوژیکی مرغ های آلوده و غیر آلوده به تحت تیپ H9N2 دررقت سرمی تهیه شده را متمایزنماید)، انجام شد. نتایج NS1-ELISA مشابه با آزمایش وسترن بلات بودند. با وجود این آزمایش NS1-ELISA برای بیشتر سرم های حاصل از مر غ های سه بار واکسینه شده مثبت بودند. در این مطالعه NS1-iELISA هیچ واکنش متقاطعی با سرم های مثبت سایر بیماری های طیور نشان نداد. در مقایس? NS1-ELISA با آزمایشات الیزای تجاری و HI، مشخص گردید که NS1-ELISA کاملاً آزمایش حساسی می باشد. نتایج الیزای تجاری و نیز تیتر آنتی بادی HI حاصل از نمونه هایی که در همه پرندگان مورد ارزیابی قرار گرفتند، نشان دهنده همخوانی بالای میان این آزمایشات می باشد. این یافته ها نشان داده که پروتئین نوترکیب NS1 26 کیلودالتونی بیان شده با استفاده از پلاسمید pMAL-c2X می تواند در استراتژی DIVA جهت تمایز مرغ های آلوده به ویروس آنفلوانزای طیور و مرغ های واکسینه شده مورد استفاده قرار گیرد.
- Abstract
- Avian influenza is a viral contagious disease that affect poultry industry and human health. Vaccination has been considered as a preventive tool in the eradication of AI, but it causes some limitations including trade embargoes and interferring with serologic surveillance in differentiation between infected and vaccinated animals. Therefore, the development and application of reliable, sensitive methods for quickly serodiagnosis of H9N2 are of critical importance and necessary. The main goal of the present research was to express NS1 protein of influenza virus originating from low pathogenic avian influenza virus for using in investigation on the mechanism used by NS1 to differentiate vaccinated and naturally infected chickens. Several distinct DIVA strategies have been presented to conquer these limitations. In this study, the whole sequence and partial sequences of RNA binding and effector domain of non-structural protein 1 (NS1) of H9N2 subtype of avian influenza virus were amplified by polymerase chain reaction. After extraction and purification of NS1 sequences from agar gel, the whole sequence of NS1 gene was inserted into pMAL-c2X plasmid and the two other partial sequences inserted into pGEX-4T-1 separately and amplified by transfering using electroporation procedure in DH5? strain of Escherichia coli . The E.coli colonies possessing recombinant NS1 genes were screened using PCR assay, restriction mapping and sequencing analysis. The recombinant NS1 proteins were expressed and puri fied using affinity chromatography based on MBP (pMAL-c2X) or GST (pGEX-4T-1) and 6xHis. The molecular weight of MBP-NS1 protein on SDS-PAGE showed a band of 68 kDa, and the two truncated GST-NS1 protein showed a band of about 31kDa for both of them. Western blotting only with whole sequence of NS1 protein showed desired response using antisera obtained from chickens vaccinated, naturally infected and challenged with a H9N2 subtype strain. The most sera prepared from H9N2 vaccinated chickens were negative in WB analysis. The indirect enzyme linked immunosorbent assay for detection of antibodies specific for NS1 protein of H9N2 subtype, has been set up successfully by using of recombinant NS1 protein as an antigen that could sero-diagnose the infected and non infected chickens with H9N2 at the serum dilution prepared. The results of NS1-ELISA were also the same as western blot test. However, NS1-ELISA tests were positive for most of sera from chickens vaccinated thrice too. In this study, the NS1-iELISA had no cross-reactivity with known positive sera for other diseases of poultry. In comparison of the NS1-ELISA to HI and commercial ELISA tests, it was found that this test is completely sensitive. The results of commercial ELISA and HI antibody titer from the similar samples were investigated in all of the birds, demons-trating a high diagnostic correlation between these tests. These findings indicated the rNS1 protein of 26 kDa expressed by Pmal-c2X plasmid can be used in a DIVA strategy test for differen-tiation of AI infected and vaccinated chickens.
