عنوان پایان‌نامه
بیان وتولیدپروتئین نوترکیب پروتواسکولکس EPC۱ به منظور استفاده در آزمونهای تشخیصی سرولوژیک هیداتیدوزیس واکینو کوکوزیس
- رشته تحصیلی
- انگل شناسی دامپزشکی
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه دانشکده دامپزشکی شماره ثبت: 545 ت;کتابخانه دانشکده دامپزشکی - مخزن مرد آباد شماره ثبت: 545 ت;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 62419
- تاریخ دفاع
- ۱۳ شهریور ۱۳۹۲
- دانشجو
- سمیه کردافشاری
- استاد راهنما
- سیدحسین حسینی, فاطمه جالوسیان
- چکیده
- مقدمه اکینوکوکوس گرانولوزوس عامل بیماری سیستیک اکینوکوکوزیس است که یکی از مهمترین بیماریهای انگلی انسان و حیوانات در سراسر دنیا محسوب می شود. از آنجایی که سگ نقش اساسی را در انتقال آلودگی سیستیک اکینوکوکوزیس دارد، تشخیص این انگل در سگ به عنوان میزبان اصلی نقش مهمی را در موفقیت برنامههای کنترلی در مناطق اندمیک ایفا میکند. طیف وسیعی از روشهای تشخیصی بدین منظور مورد استفاده قرار گرفتهاند. بکارگیری یک سیسستم تشخیصی ایمیونولوژیک یا سرولوژیک ساده با حساسیت بالا میتواند نقش بسزایی را در کنترل این آلودگی ایفا نماید. امروزه آنتی ژنهای نوترکیب متعددی در زمینهی تشخیص این انگل بکار میروند که عمدتاً قادر به تشخیص آلودگی در انسان هستند. آنتی ژن نوترکیب EPC1 در استرالیا آلودگی را در انسان تشخیص داده است ولی گزارشی مبنی بر کاربرد این آنتی ژن در تشخیص سگ منتشر نشده است. لذا بیان و تولید پروتئین مذکور همراه با نشاندارسازی آن با نانو ذرات طلا در پژوهش حاضر به مرحله‌ی اجرا گذارده شد. مواد و روش کار با مراجعه به کشتارگاههای اطراف تهران، کبد و ریه گوسفندان آلوده به کیست هیداتیک جمع آوری و به آزمایشگاه منتقل گردید. آنتی ژن پروتواسکولکس طبق روش معمول تهیه آنتی‌ژن خام تهیه شد. به منظور ایجاد آلودگی تجربی تعداد 10 قلاده سگ خریداری و به سه گروه به شرح زیر تقسیم شدند: گروه اول شامل 4 قلاده سگ دریافت کننده70000-50000 پروتواسکولکس گروه دوم شامل 4 قلاده سگ دریافت کننده 8000 پروتواسکولکس گروه سوم شامل 2 قلاده سگ به عنوان گروه شاهد از سگ‌های تحت تجربه قبل از ایمیونیزاسیون و در مدت نگه‌داری در3 نوبت (روزهای 15، 28 و 35) بعد از چالش خونگیری به عمل آمد. RNA بصورت کامل از پروتواسکولکسهای خارج شده از کیست هیداتیک گوسفندی استخراج و سنتز mRNA و cDNA از روی آن انجام گرفت. پس از تکثیر قطعه EPC1 به روش PCR ، محصول آن تخلیص گردید. سپس محصول PCR(EPC1) و DNA وکتور با دو آنزیم برشی محدودالاثر EcoRI و BamHI برش داده شدند و عمل لیگاسیون صورت گرفت. محلول لیگاسیون تهیه شده به باکتری پذیرا شده( E. Coli) Top10افزوده شد و در محیط LB حاوی کانامایسین به مدت 18 ساعت در 37 درجه سانتی‌گراد کشت داده شد. پس از استخراج پلاسمید نوترکیب، جهت تایید صحت کار، colony-PCR و هضم آنزیمی انجام پذیرفت. جهت القاء بیان ژن EPC1 در پلاسمید بیانی pET28a، پلاسمید نوترکیب به باکتری BL21 منتقل شد و به مدت 18 ساعت در محیط کشت حاوی کانامایسین در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه گردید. پس از رسیدن به OD 5/0 – 6/0 القای بیان ژن در شرایط 33 درجه سانتی‌گراد و غلظت 5/0 میلی مولار IPTG انجام شد. جهت استخراج پروتئین نوترکیب از باکتری القا شده از کیت Ni-NTA Agarose استفاده گردید. پروتئین تخلیص شده به روش SDS-PAGE ارزیابی شد. آزمایش وسترن‌بلات ابتداً با آنتی بادی مونوکلونال T7 tag صورت گرفت و پس از تایید تولید EPC1 ، 2 سر خرگوش با این آنتی‌ژن ایمن شدند و در مرحله ی بعد وسترن بلاتینگ با سرم خرگوش‌های ایمن شده و سگ‌های آلوده نیز انجام شد. عیارسنجی آنتی¬بادی در سرم خرگوش‌های ایمن شده و سگ‌های آلوده به روش الایزای غیرمستقیم و همچنین عیارسنجی آنتی¬بادی در 80 نمونه سرم انسانی به روش ساندویچ الایزا صورت پذیرفت. در مرحله بعد، آنتی¬ژن نوترکیب EPC1 با نانو ذرات طلا نشان‌دار گردید. سپس سرم سگ‌های آلوده، سگ‌های خانگی و سرم‌های انسانی توسط روش DIGFA و با استفاده از آنتی¬ژن نوترکیب ¬ EPC1 نشان‌دار شده با کلوئید طلا مورد آزمایش قرار گرفتند. نتایج نتیجه حاصل از PCR توالی EPC1 باندی به طول bp 228 بود. همچنین در نتیجه PCR پلاسمید نوترکیب pET28a / EPC1 محصولی با طول bp 558 مشاهده گردید، bp 330 اضافه بر روی ژن bp 228 مربوط به بخشی از سکانس وکتور می باشد. پلاسمید نوترکیب همچنین تحت اثر آنزیم‌های محدودالاثر BamHI و EcoRI هضم شد و قطعه DNA با طول bp228 از آن خارج گردید که این روش نیز به منظور تایید حضور ژن EPC1در پلاسمید بود. تعیین توالی نوکلئوتیدی پلاسمید نوترکیب با پرایمرهای اختصاصی پلاسمید انجام گرفت. بررسی توالی نوکلئوتیدی مورد مطالعه نشان داد که این توالی دارای(ORF) Open Reading Frame از نوکلئوتید 1 تا 228بود و در نتیجه قابلیت ترجمه و بیان ژنتیکی به پروتئینEPC1 را دارا بود. پس از انجام تعیین توالی نوکلئوتیدی ، توالی بدست آمده با توالی‌های موجود در بانک ژنتیک با استفاده از نرم‌افزار online، Blast شد. توالی نوکلئوتیدی مورد مطالعه دارای 100% مشابهت نوکلئوتیدی با توالی ثبت شده در بانک جهانی ژنتیک مربوط به EPC1 بود. نتیجه حاصل از بیان ژن ، بروی ژل 12% SDS-PAGE باندی به اندازه 8/12 kDa بود. همچنین در نتیجه واکنش rEPC1 با آنتی بادی مونوکلونال T7 tag ، سرم سگ‌های آلوده و خرگوش‌های ایمن شده در روش وسترن بلات، باند 8/12 kDa مشاهده گردید. حساسیت و ویژگی آزمون الایزای انجام شده با پروتئین نوترکیب EPC1 در استفاده از سرم خرگوش‌های ایمن شده 100%و 100% بدست آمد. در ادامه آنالیز نتایج، حساسیت، ویژگی، ارزش اخباری مثبت و ارزش اخباری منفی تست انجام شده در مورد سرم سگ‌ها به ترتیب 100% ، 91%، 8/88% و 100% محاسبه گردید. در نتیجه انجام ساندویچ الایزا بروی سرم‌های انسانی حساسیت، ویژگی ارزش اخباری مثبت و ارزش اخباری منفی به ترتیب100% ، 15/92%، 18/89% و 100% گزارش گردید. واکنش پروتئین EPC1 نشان‌دار شده با نانو ذرات طلا و سرم سگ‌های آلوده به صورت لکه¬های بنفش با ذرات آگلوتیناسیون ظاهر شد که بنحو مطلوبی قابل رویت است. بحث تاکنون در ایران بروی آنتی ژن نوترکیب پروتواسکولکس مطالعه‌ای صورت نگرفته است در حالی که این آنتی ژن قادر است کیست هیداتیک را در میزبان واسط و کرم بالغ را میزبان نهایی تشخیص دهد. مطالعات سایر محققان نشان می دهد که این آنتی‌ژن بهترین مارکر تشخیص سرمی هیداتیدوزیس بشمار می‌آید. بطورکلی میتوان گفت نتیجه مطالعه پیش روی منجر به ارایه روش تشخیصی شده است که از سرعت، دقت و حساسیت مطلوبی برخوردار می‌باشد.
- Abstract
- Introduction Echinococcus granulosus is the causative agent of cystic echinococcosis (CE), which is considered to be one of the most important global parasitic infectious diseases of humans and animals and is widespread around the world. Because of the dog’s primary role in the transmission dynamics of CE, detection of E. granulosus in the definitive host plays a significant role in implementing hydatid control programs in endemic areas. A wide range of diagnostic methods have been used for diagnostic purposes. Application of a simple and a sensitive immunological or serological detection system could be a useful adjunct in control programs. Accurate immunodiagnosis of the infection requires highly specific and sensitive antigens to be used in immunodiagnostic assays. A number of recombinant proteins are available now as candidate antigens for the immunodetection of E. granulosus, mainly in humans. A recombinant antigen, EPC1, a 8.5-kDa antigen from E. granulosus, has been shown to be effective for diagnosis of human hydatidosis in Australia but no report is published about the usefulness of this recombinant antigen for detection of dog echinococcosis. Materials and Methods Liver and lung hydatid cysts from naturally infected sheep were collected from slaughterhouses. Protoscoleces were collected aseptically from fertile cysts. Then in order to Challenge of dogs, ten dogs placed at random in three groups. The first group and second group (4 dogs in each group) were infected orally with 50000-70000 and 8000 protoscoleces, respectively. The third group containing 2 dogs was used as uninfected controls. For all dogs, blood was sampled on four occasions, including before infection, 15, 28 and 31 days post infection. Total RNA was extracted immediately from protoscoleces then strand cDNA was synthesized using Reverse Transcriptase. The EPC1 gene of E. granulosus was amplified by PCR and the PCR product was purified and digested with BamH? and EcoR? and consequently the expression plasmid vector pET28a was double digested with the same restriction endonucleases as mentioned above. The ligation product was transformed into competent Top10 E. coli strain, and cultured in Luria-Bertani broth medium free antibiotic by incubating for 1h at 37 ?C with shaking. These transformed bacteria were plated onto LB agar plates containing kanamycin 1 mg/ml and incubated at 37 ?C for 16-18h. The recombinant plasmid containing EPC1 was extracted using a Plasmid Extraction Kit. Consequently presence of insert was confirmed by colony PCR using specific primers for pET28a vector and enzyme digestion with the EcoRI and BamHI. In order to express rEPC1, recombinant plasmid pET28a was transformed into competent E. coli BL21 cells and grown overnight in LB medium containing kanamycin 1mg/ml until an OD650 of 0.5-0.6 was achieved. Protein expression was induced at 33°C for 6 h in the presence of isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) at a final concentration of 0.5 mM. The recombinant His6-tagged EPC1 was purified from the extract of transformed E. coli BL21 by Ni-NTA agarose Kit. The purified His6-tagged protein was analyzed by SDS–PAGE. For Western blot analysis were done against, T7 tag antibody. After confirmation of rEPC1 production, 2 rabbits were immunized against rEPC1 and their blood samples were taken after 3 injections of rEPC1. Western blot was performed with sera of infected dogs and immunized rabbits, as well. Indirect ELISAs for the detection of antigen-specific antibodies in serum samples of dogs and rabbits and sandwich ELISA for 80 human sera were done to test the diagnostic value of the recombinant protein EPC1. In the next step, rEPC1 was labeled with colloidal gold in order to using in DIGFA test. A drop of the labeled rEPC1 was spotted onto the nitrocellulose paper and was dried at room temperature. Then was rinsed with the PBS-T and serum was dripped slowly to the membrane and membrane was incubated at RT for 3 minutes. Positive results were decided by the appearance of regular, round, purple dot at the center of each paper. The negative result was that no dot appeared on the square and only irregular, light purple trace appeared. Results The PCR products showed bands of 228 bp representing of EPC1. Nucleotide sequence analysis revealed that a putative 228-bp length PCR amplicon encodes a 79-amino acid peptide with an expected molecular mass of 8.6 kDa (12.6 KDa plus 6-His-Tag). Colony PCR products with universal primers indicated bands of 500 bp representing EPC1 with some parts of pET28a. . Also enzyme digestion products on the agarose gel showed bands of 5369 bp and 228 bp belonged to pET28a and EPC1 respectively. Nucleotide sequencing revealed that both the sequence and the reading frame of the inserted EPC1 fragment were accurate The SDS–PAGE staining results demonstrated that the His-tagged EPC1 protein was successfully expressed in BL21 cells and purified efficiently from E. coli lysate. The result of purified EPC1 Western blot analysis using T7 tag antibody, dogs and rabbits sera showed a specific band of 12.8 kDa. All infected dogs were Ab ELISA positive and ELISA analysis showed that the sera collected from infected dogs at day 15 (15 days post infection) contained the highest titer of IgG antibody. Moreover, one false-positive case was detected among the 12 samples from domestic dogs. Consequently based on these findings the overall sensitivity, specificity, positive and negative prediction values were calculated as 100%, 93.3%, 88.8% and 100%. Among 80 human sera tested, 37 human showed anti-rEPC1 antibody response at different levels. In fact four false-positive cases were detected with regards to analyzing the rEPC1 among the 47 samples from healthy donors and the overall sensitivity, specificity, positive and negative prediction values were calculated as 100%, 92.1%, 89.1% and 100%. Seven dogs from infected ones exhibited dot reaction in DIGFA and 2 control dogs were negative. The sensitivity, specificity, positive and negative prediction value of DIGFA test were 88.8%, 100%, 100% and 66.6% respectively. Conclusion In conclusion, we successfully cloned and expressed the gene encoding for EPC1, a protoscolex-specific component of E. granulosus. Our preliminary results showed that recEPC1 demonstrates a very good performance as an antigenic marker for the serological diagnosis and screening of dog echinococcosis and Human hydatidosis. We suggest that recEPC1 serology should be more intensively tested with sera of dogs infected with other infections especially with other family Taeniidae to provide a more extensive documentation of the cross reactions with other infections. After all, CE remains an important health problem in many areas of Iran. So effective programmes need to be implemented for controlling and reducing the disease in livestock, carnivores especially dogs and also humans in Iran.
