عنوان پایان‌نامه
کنترل کریپتو سپورید یوز گوساله
- رشته تحصیلی
- بیماریهای داخلی دامهای بزرگ
- مقطع تحصیلی
- دکترای تخصصی
- محل دفاع
- کتابخانه دانشکده دامپزشکی شماره ثبت: 549 ت;کتابخانه دانشکده دامپزشکی - مخزن مرد آباد شماره ثبت: 549 ت;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 59042
- تاریخ دفاع
- ۳۱ شهریور ۱۳۹۲
- دانشجو
- فیصل ضرغامی
- استاد راهنما
- محمدرضا مخبردزفولی
- چکیده
- کریپتوسپوریدیوم پارووم تک یاخته ای از شاخه اپی کمپلکساست که در بسیاری از حیوانات و انسان ایجاد اسهال می نماید. تا کنون هیچ گونه درمان موثری برای آن شناخته نشده است. در سالهای اخیر ایمن سازی به عنوان استراتژی مناسب جهت کنترل وپیشگیری مورد توجه قرار گرفته است. در این مطالعه مدفوع اسهالی گوساله مشکوک به کریپتوسپوریدیوز ، جمع آوری و به روش ذیل نلسون اصلاح شده رنگ آمیزی گردید. حضور کریپتوسپوریدیوم بر اساس ساختار مرفولوژیک و رنگ پذیری اجرام انگلی تایید و سپس اووسیست های مدفوع با استفاده از روش وینتر و همکاران(2000) جداسازی و تخلیص گردیدند. آزمایش PCR و semi- nested PCR بر روی اووسیست های تخلیص شده انجام شد که C.Parvum را تایید نمود.در مرحله بعد به منظور تولید اووسیست های بیشتر یک راس گوساله یک روزه با 107× 1 اووسیست کریپتوسپوریدیوم پارووم به طریق تجربی آلوده شد.از رور 4 تا 9 پس از آلوده سازی مدفوع گوساله جمع آوری شد.جهت جداسازی اولیه اووسیست های کریپتوسپوریدیوم پارووم چهار روش شناورسازی شامل استفاده از محلول نمک طعام، ساکارز اشباع، شیب غلظتی پلکانی فایکول و محلول 55% ساکارز استفاده شد و در نهایت ساکارز 55% (روش وینتر وهمکاران2000) بهترین روش جهت جداسازی ارزیابی گردید.تایید مولکولی گونه پارووم اووسیست های تخلیص شده توسط semi- nested PCR انجام شد. به منظور تهیه آنتی ژن خام C.Parvum 106×600 اووسیست در دمای 121 درجه سانتی گراد و فشار 1.5 بار اتوکلاو شدند ودر مرحله بعد شکسته شدن دیواره اووسیست های اتوکلاوشده با استفاده از دستگاه سنیکاتور و پس از آن با 3 بار عمل انجماد- ذوب انجام شد.جهت تهیه آغوز هایپر ایمن ، 6 راس گاو هلشتاین آبستن 70 روز قبل از زایمان به طور تصادفی به 2 گروه آزمایش و شاهد (هر کدام 3 راس) تقسیم شدند. سپس مخلوط420 میکروگرم آنتی ژن خام کریپتوسپوریدیوم پارووم و 5/1 میلی لیتر PBS( pH=7/2 ) در 5/1 میلی لیتر ادجوانت کامل فروند امولسیفه و به صورت زیر پوستی در سطح جانبی گردن گاوهای آزمایش تزریق شد. در گاوهای آزمایش سه بار بعد از تزریق اولیه، ایمن سازی با تزریق 420 میکروگرم آنتی ژن در 5/1 میلی لیتر PBS( pH=7/2 ) + 5/1 میلی لیتر ادجوانت ناقص فروند با فواصل 2 هفته تکرار شد. در گاوهای شاهد تزریق های مشابه انجام شد با این تفاوت که از PBS به جای آنتی ژن استفاده گردید. پس از تولد، گوساله های هر 2 گروه در ساعتهای 12،2و24 به ترتیب 2،3و1 لیتر آغوزدوشش اول و در روز دوم آغوز دوشش دوم دریافت کردند.به گوساله های شاهد و آزمایش 107× 1 اووسیست کریپتوسپوریدیوم پارووم در ساعت 12 پس از تولد خورانده شد. به منظور ارزیابی بالینی ایمن زایی، معیارهای بالینی شامل نشانه های حیاتی، قوام و رنگ مدفوع، غیر طبیعی های مدفوع ، وضعیت اشتها، دپرسیون و دهیدراتاسیون روزانه 2 بار بررسی می شد. نمونه های مدفوع 2 بار در روز از گوساله ها اخذ و بعد از رنگ آمیزی جهت تعیین حضور اووسیست ها، مورد برسی میکروسکوپی قرار می گرفت. به منظور تعیین میزان اووسیست های دفع شده، یک گرم مدفوع با استفاده از روش وینتر شناور شده و تعداد اووسیست های تخلیص شده با استفاده از لام نئوبار شمارش گردید. گوساله های شاهد از روز 4 پس از عفونت دپرسیون قابل توجه و کاهش اشتها را نشان دادند و به دنبال آن اسهال آبکی زرد رنگ تا رنگ پریده و توده های موکوسی ظاهر شد که به مدت 6 تا 7 روز ادامه داشت.در هیچکدام از گوساله هایی که آغوز هایپر ایمن دریافت کرده بودند اسهال و سایر نشانه های بالینی ظاهر نشد و اشتهای طبیعی داشتند. در گوساله های شاهد دفع اووسیست از روز 4 پس از عفونت شروع و تا روز 11 ادامه داشت در حالیکه در گروه آزمایش از روز 8-7 پس از عفونت شروع شد و دوره کمون 5-4 روز طولانی تر گردید.اختلاف گوساله های شاهد و آزمایش در شروع دفع اووسیست معنی دار بود( 001/0 > P) . حداکثر دفع اووسیست در گوساله های شاهد و آزمایش به ترتیب در روزهای 6 و 9 پس از عفونت رخ داد. میانگین حداکثر دفع اووسیست در گوساله های شاهد 35 برابر بیشتر از گوساله های آزمایش بود. استفاده از آغوز هایپر ایمن در گوساله های آزمایش میانگین دفع اووسیست را تا میزان 97% برابر کاهش داد. کاهش در میزان دفع اووسیست در گروه آزمایش در مقایسه با گروه شاهد دارای اختلاف معنی دار بود( 05/0> P). بیشترین کاهش دفع اووسیست در روز 7 پس از عفونت در گروه آزمایش رخ داد. بر اساس نتایج دات بلات همه گاوهای آزمایش و شاهد قبل از ایمن رایی دارای تییتر آنتی بادی ضد C.Parvum در سرم بودند. بعد از ایمن زایی تیتر آنتی بادی در سرم و آغوز گاوهای آزمایش به طور معنی داری بیشتر(به ترتیب 35 برابر و 20 برابر) از گاوهای شاهد بود(025/0=P). عدم حضور اسهال و سایر نشانه های بالینی و همچنین کاهش قابل توجه در دفع اووسیست نشان می دهد که آغوز های هایپر ایمن تولید شده از طریق ایمن زایی با آنتی ژن خام کریپتوسپوریدیوم پارووم تهیه شده در این تحقیق محافظت کاملی در برابر کریپتوسپوریدیوز در گوساله ها ایجاد می کند.
- Abstract
- Cryptosporidium parvum is an apicomplexan protozoan parasite which causes diarrhea in both human and wide range of animals. No efficacious treatment has been described for it. Immunization has been focused as a preffered strategy to control and prevention of cryptosporidiosis in the current years. In this study, diarrheatic fecal samples of calves suspected for cryptosporidiosis were collected and oocysts were stained by modified Ziel- Nelson staining. Presence of cryptosporidium was confirmed based on morphologic sracture and staining of parasites then purification and isolation of oocysts were done by winter, et al (2000) method. Purified oocysts were analysed by PCR and semi- nested PCR which confirmed C.Parvum. One day calf was experimentally infected with 1× 107 C.Parvum oocysts to produce enough oocysts for further analysis. Feces containing of oocysts were collected from 4 to 9 days post inoculation (DPI). In order to isolate C.Parvum oocysts four floatation methods including NaCl floatation, sucrose floatation, ficol gradient and 55% sucrose floatation (winter method) have been used. Winter method was evaluated as the best method for isolation and concentration of C.parvum oocysts. Genus of parvum confirmed by semi- nested PCR of purified oocysts. In order to prepare C.parvum whole antigen, 600×106 oocysts were autoclaved at 1210C and 1/5 bar pressure for 20 minutes then outoclaved oocysts wall were disrupted by sonication and 3 cycles freezing- thawing. In order to prepare hyper immune colostrums, six Holstein cows were randomly divided into test and contol group (each group containing 3 cows) 70 days before partrition then 420 µg of C.Parvum antigen mixedvwith 1/5 ml PBS ( pH=7/2 ) was emulsified with on equal volume (1/5 ml) of Freunds compelet adjuant then subcutaneously was injected into lateral aspect of the neck in test group cows.tset group were boosted 3 times after rthe first immunization (with 2weeks intervals) with injection composing of 420 µg antigen mixed in 1/5ml PBS( pH=7/2 ) + 1/5 ml incompelet Freunds adjuant. In control cows same injections were done with PBS instead of C.Parvum antigen. After the birth, calves of the both group recived3L, 2L and 1L from their doms, first milking colostrums respectively at 2, 12 and 24h postpartum then they fed second milking colostrums in 2th day postpartum. Calves of test and control group were inoculated with 1×107 C.Parvum oocysts at 12h postpartum. In order to clinical evaluation of immunization, clinical indexes including vital signs, feces consistency and colour, abnormality in feces, appetite status and dehydration and depression were examined twice dayly.fecal samples were collected from calves twice daily postinoculation and examined microscopically after acidfast staining to determine presence of oocysts.to quantitative examination of number oocysts, 1g from feces were floated by winter method and purified oocysts conted in neobaur haematocytometer. Control calves were noticeably depressed and decreased appetite from 4 DPI and subsequently watery diarrhea became apparent with colour change to yellow or pale and contain clumps that lasted for 6-7 days. None of calves’ recived hyperimmune colostrum developed diarrhea and other clinical signs and they had normal appetite. Oocyst excertion started at 4 DPI and lasted until 11 DPI in control calves while in test group oocyst shedding started at 7-8 DPI and incubation period was delayed for 4-5 days. Difference in start of oocyst shedding was significant between test and control calves (P?0/001). Peak of oocyst shedding occurred in test calves at 9 DPI and in controlcalves it occurred at 6 DPI. Mean of oocyst excertion peak in control calves was 35 times higher than it in test calves (97% reduction in oocyst excertion). Hyperimmune colostrum reduced oocyst shedding up to 350 times in test group. Number of excerted oocysts in test calves were significantly lower than it in control group from 4 to 11 DPI( P?0/05). The most reduction in oocyst shedding in the test group compared to control group was occurred at 7 DPI. According to dot blot results, all the cows were seropositive before immunization (1/200). After immunization titres of anti- C.Parvum antibodies in the sera and colostrums of test cows were significantly higher than control cows (P?0/025)(respectively 35 times and 20 times higher). Titres of sera anti- C.Parvum antibodies in test calves increased to 20 times compared to control calves. The absence of diarrhea and other clinical signs and alsosignificant reduction in oocyst excertion indicates that immune colostrums induced by immunization with C.Parvum whole antigen provided substantial protection against cryptosporidiosis in neonatal calves.
