عنوان پایان‌نامه
تعیین بیومارکهای سرمی
- رشته تحصیلی
- کلینیکال پاتولوژی دامپزشکی
- مقطع تحصیلی
- دکترای تخصصی
- محل دفاع
- کتابخانه دانشکده دامپزشکی شماره ثبت: 532 ت;کتابخانه دانشکده دامپزشکی - مخزن مرد آباد شماره ثبت: 532 ت;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 58427
- تاریخ دفاع
- ۰۹ اردیبهشت ۱۳۹۲
- دانشجو
- محمد زمانی احمد محمودی
- استاد راهنما
- سیدمهدی نصیری
- چکیده
- پروتئومیکس روشی است که در آن به آنالیز حجم عظیمی از پروتئین های سلولی با استفاده از تکنیک های مختلف پرداخته می شود. یکی از تکنیک های پروتئومیکس روش سرپا (Serological proteome analysis: SERPA) است که در آن به کمک الکتروفورز دو بعدی و وسترن بلات آنتی بادی های راکتیو علیه آنتی ژن های توموری شناسایی می شود. در تحقیق حاضر با استفاده از این تکنیک بیومارکرهای سرمی علیه تومورهای پستانی سگ مطالعه شدند. نمونه های سرمی و بافت های توموری از 15 سگ مبتلا به تومور پستان و سرم 15 سگ ماده سالم اخذ شد. سلول های یکی از نمونه های بافت توموری بوسیله کلاژناز جدا و برای بیش از 50 بار پاساژ (کشت) داده شد. جهت تایید سلولهای جدا شده بعنوان یک سل لاین کارهای مختلفی شامل بررسی ویژگی های رشد, توانایی تشکیل کولونی در آگار, توانایی تهاجم بدرون ماتریکس خارج سلولی, آنالیز کروموزومی, ایمنوسیتوشیمی فیلامان های بینابینی و رسپتورهای استروئیدی, RT-PCR سیتوکراتین های 8-14 و 18, و بررسی الگوی الکتروفورز دو بعدی انجام شد. بررسی های نشان داد سلولهای جدا شده دارای سه فاز رشد شامل فاز نرمال, دورمانت (Dormant) و نامیرایی (Immortal) بود. همچنین این سل لاین بخوبی توان تشکیل کولونی های متعدد درون آگار را داشت ولی توانایی تهاجم آن بدرون ماتریکس خارج سلولی پایین بود. سل لاین به لحاظ مارکرهای پن سیتوکراتین, سیتوکراتین با وزن مولکولی پایین, ویمنتین و رسپتور استروژن مثبت و به لحاظ سیتوکراتین با وزن مولکولی بالا و رسپتور پروژسترون منفی بود. آنالیز الکتروفورز دو بعدی بوسیله نرم افزار Melanie7. نشان داد که الگوی دو بعدی در طی پاساژهای مختلف ثابت مانده است. در ادامه از همین سل لاین جدا شده بعنوان منبع پروتئینی برای الکتروفورز دو بعدی استفاده شد. پس از الکتروفورز دو بعدی, پروتئین های جدا شده بروی کاغذ مخصوص وسترن بلاتینگ منتقل شدند تا با سرم های افراد بیمار و سالم انکوبه شوند. نتایج وسترن بلاتینگ نشان داد که 8 نقطه پروتئینی با سرم افراد توموری و سالم واکنش مثبت نشان دادند. از این 8 نقطه (پروتئین) 4 پروتئین بعنوان بیومارکرهای ارزشمند تشخیص داده شدند چرا که بصورت معناداری در نمونه های توموری بیش از نمونه های سالم واکنش نشان دادند. این چهار پروتئین به کمک روش مس اسپکترومتری (Mass spectrometry: MS) شناسایی شدند. این بیومارکرها شامل آلفا انولاز (ENO1) , تریوز فسفات ایزومراز (TIM), منیزیوم سوپراکسید دیسموتاز (Mn-SOD) و فسفوگلیسیرات موتاز1 (PGAM1) بودند که افزایش بیان آنها از طریق ایمنوهیستوشیمی (IHC) نشان داده شد. این بیومارکرهای سرمی برای اولین بار مورد شناسایی قرار گرفتند که می توان در آینده جهت مطالعات بیشتر برای تشخیص زودهنگام تومور پستانی در سگ مورد استفاده باشند.
- Abstract
- Proteomics is a high throughput method for the evaluation of the many proteins simultaneously. Serological proteome analysis (SERPA) as a proteomics technique detects autoantibodies against tumor antigens using 2-DE and western blotting. Current investigation studied serum autoantibodies against canine mammary gland tumor antigens. Sera and tumor samples (n=15) and sera (n=15) were collected from dogs with mammary gland tumor and healthy control respectively. One tumor samples was dissociated by collagenase and subcultured over 50 times. Cultured cells were evaluated through various assays including growth rate, colony forming assay, migratory potency, chromosomal analysis, immunecytochemistry for steroid receptors and intermediate filaments, RT-PCR for cytokeratins (CKs) 8, 14, and 18, and 2-DE pattern. The cell line revealed three growth phases including, normal, dormant, and immortal phase. The cell line formed many colonies into the agar matrix and showed low invasion potency into the extracellular matrix. Pancytokeratin, CK low and estrogen receptor (ER) expression was positive and CK low and progesterone receptor (PR) expression was negative. 2-DE pattern was stable during cell passages (Melanie 7.). Characterized cell line was used as protein source for the 2-DE assay. Protein were separated by 2-DE and transferred onto the PVDF membrane. Tumor antigens were incubated with normal or tumor serum samples. Eight reactive spots were detected in the tumor and healthy samples. Four out of 8 spots (proteins) were considered valuable biomarkers including alpha-enolase (ENO1), triose phosphate isomerase (TIM), phospho gleycerate mutase 1 (PGAM1), and Mn-superoxide dismutase (Mn-SOD). Overexpression of the ENO1, Mn-SOD, and TIM were demonstrated by IHC assay. These biomarkers identified for the first time, can be used for the early diagnosis of the canine mammary tumor.
