عنوان پایان‌نامه
در مقایسه عفونت
- رشته تحصیلی
- دامپزشکی
- مقطع تحصیلی
- دکتری عمومی
- محل دفاع
- کتابخانه دانشکده دامپزشکی شماره ثبت: 3496;کتابخانه دانشکده دامپزشکی - مخزن مرد آباد شماره ثبت: 3496;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 65541
- تاریخ دفاع
- ۲۹ بهمن ۱۳۹۲
- دانشجو
- سمیرا سیف
- استاد راهنما
- شهرام جمشیدی
- چکیده
- لیشمانیازیس یکی از مهم ترین بیماری های مشترک انسان و دام می باشد که توسط انواع مختلفی از سویه های لیشمانیا ایجاد می شود. این بیماری درکشور های در حال توسعه از جمله ایران به عنوان یک معضل اساسی مطرح بوده و ایران یکی از مناطق آندمیک لیشمانیوز پوستی و احشایی محسوب می گردد. در حال حاضر استفاده از روشی حساس و کارآمد جهت ارزیابی عفونت زایی و بررسی پیشرفت لیشمانیوزیس در مراحل اولیه بیماری بسیار حائز اهمیت می باشد. لذا استفاده از ژن های گزارش گر می تواند گزینه مناسبی جهت دستیابی به این هدف باشد. از این رو، در این پژوهش از انگل های نوترکیب بیان کننده ژن های گزارش گر EGFP و LUC استفاده شد و برای نخستین بار مقایسه عفونت زایی رده انگلی لیشمانیا ماژور سویه وحشی با دو رده انگلی ترانسفکت شده با ژن های گزارش گر EGFP و EGFP-LUC صورت گرفت. در این پژوهش، موش های BALB/c به 3 گروه 15تایی تقسیم شده و لیشمانیا ماژور ترانسفکت شده با EGFP، EGFP-LUC و لیشمانیا ماژور سویه وحشی به کف پای موش های BALB/c تزریق شد. بررسی عفونت زایی در شرایط in vivo با استفاده از سیستم تصویربرداری و اندازه گیری قطر کف پا انجام شد و نیز تکنیک هایی نظیر فلوسیتومتری، تخمین میزان بار انگلی غدد لنفاوی و طحال با استفاده از روش رقت سازی محدود و میکروسکوپ فلورسنت 1 ماه و 2 ماه پس از چالش مورد استفاده قرار گرفت. براساس نتایج این مطالعه، میزان تورم در ناحیه کف پای موش و همچنین میزان بار انگلی در غدد لنفاوی و طحال، در گروه ترانسفکت شده با ژن گزارش گر EGFP به طور معناداری بیشتر از دو گروه دیگر بود. همچنین 4 و 8 هفته پس از چالش، مقایسه میزان بیان EGFP در سوسپانسیون غدد لنفاوی دو گروه ترانسفکت شده با ژن های گزارش گر حاکی از بیشتر بودن میزان بیان EGFP در گروه ترانسفکت شده با EGFP نسبت به گروه ترانسفکت شده با EGFP-LUC بود (05/0< p). به علاوه نتایج تصویربرداری 1 ماه و 2 ماه پس از چالش نشان داد میزان تراکم نور ناشی از لوسیفراز در گروه ترانسفکت شده با EGFP-LUC 2 ماه پس از چالش حدوداً 1/2 برابر این تراکم 1 ماه پس از چالش بود و میزان تراکم نور سبز ناشی از بیان EGFP در دو گروه ه دارای ژن های گزارش گر 1 ماه پس از چالش بین دو گروه تفاوت معناداری نداشت، اما 2 ماه پس از چالش میزان بیان EGFP در گروه ترانسفکت شده با EGFP به طرز معناداری از گروه ترانسفکت شده با EGFP-LUC بیشتر بود. به طور کلی مقایسه بیان EGFP و LUC در دو گروه ترانسفکت شده با ژن های گزارش گر نشان داد حساسیت ژن گزارش گر لوسیفراز از EGFP بیشتر بود. مطالعات in vivo و in vitro پس از دو بار تکرار آزمایشات، حاکی از بالاتر بودن میزان عفونت زایی در گروه چالش شده با انگل لیشمانیا ماژور ترانسفکت شده با EGFP در مقایسه با دو گروه دیگر بود، به عبارت دیگر احتمال می رود پروتئین GFP خاصیت ایمونوژنیسیته داشته و ممکن است با تأثیری که بر انگل های لیشمانیا می گذارد سبب افزایش حدت بیماری زایی در موش های BALB/c شود. همچنین استفاده از ابزارهای نوین نظیر سیستم تصویربرداری و فلوسیتومتری می تواند در کنار روش های استاندارد نظیر اندازه گیری قطر کف پا با استفاده از کولیس و یا تعیین میزان بار انگلی با استفاده از روش رقت سازی محدود گزینه مناسبی جهت بررسی عفونت زایی در موش های آلوده با انگل های لیشمانیای ترانسفکت شده باشد.
- Abstract
- Leishmaniasis is one of the major infectious zoonotic diseases which are caused by different leishmania spp. This disease hits developing countries such as Iran which is considered as an endemic area for cutaneous and visceral leishmaniasis. Recently, use of proficient and high sensitive methods which is applied for infectivity evaluation and early phase of leishmania infection has become so important. Hence, the use of reporter genes could be a precise option for achieving this goal.Accordingly, parasaties expressing reporter genes EGFP and LUC have been selected and for the first time, in this project the infectivity rate of transgenic leishmania major strains expressing enhanced green fluorescent protein (EGFP) and EGFP-Luciferase (LUC) compared with leishmania major wild type. In this study, 3groups each including 15 BALB/c mice were infected with wild type line and transgenic L. major with EGFP, and EGFP-LUC in the left foot pad. In vivo infectivity progression was monitored by Imaging System and foot pad swelling measurement performed by caliper. In addition, parasite burden in the lymph nodes of three groups was evaluated and compared with each other by using in vitro assays like flowcytometry and Epi-fluorescence microscopy for EGFP and microtitration assay 1 and 2 months post infection for all. According to this study, footpad swelling and parasite burden of lymph nodes and spleen in infected BALB/c mice by EGFP transgenic line were higher than two others groups. In addition, EGFP expression in suspension of lymph nodes in EGFP transgenic group was significantly more than EGFP-LUC transgenic group. Furthermore, the use of Imaging System showed that LUC intensity 2 months after challenge was 2/1 times more than LUC intensity 1 month later challenge in infected mice with EGFP-LUC transgenic parasites. There was not seen any significant difference between transgenic parasite lines 1 months after challenge, however, EGFP intensity was shown significant difference 2 months after challenge between L. major+EGFP and L. major+EGFP-LUC (P<0/05). Generally, data was indicated that LUC sensitivity is more than EGFP. After two trails, in vivo and in vitro studies have shown more infectivity potential in EGFP transgenic L. major line in comparison with wild type and L. major +EGFP-LUC. In other word, probably GFP is an immunogenic protein which can influence leishmania genome and may enhance parasite virulence. In vivo Imaging System and flowcytometry with common standard methods including footpad measurements with caliper and microtitration assay would be complementary in evaluation of leishmania infectivity in transgenic mice.
