عنوان پایان‌نامه
تاثیر نانوفایبرها بر تکثیر سلولهای بنیادی
- رشته تحصیلی
- مامائی و بیماریهای تولید مثل دام
- مقطع تحصیلی
- دکترای تخصصی
- محل دفاع
- کتابخانه دانشکده دامپزشکی شماره ثبت: 506 ت;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 55961;کتابخانه دانشکده دامپزشکی - مخزن مرد آباد شماره ثبت: 506 ت
- تاریخ دفاع
- ۰۸ مهر ۱۳۹۱
- دانشجو
- پیمان رحیمی فیلی
- استاد راهنما
- پرویز تاجیک
- چکیده
- سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی در علم بیولوژی سلولی جایگاه مهمی دارند. مهمترین کاربرد این سلولها در درمان نازایی، تولید دام تراریخته و حفظ باروری بیماران سرطانی می باشد. هدف از انجام این مطالعه بررسی تاثیر داربست نانورشته PLLA بر تکثیر سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی منجمد-ذوب شده گوساله 3-5 ماهه در محیط آزمایشگاه است. سلول های اسپرماتوگونی بیضه گوساله 3 تا 5 ماهه با دو مرحله هضم آنزیمی جدا و با روش حذف تمایزی خالص سازی گردید. سلول های جدا شده در چهار گروه کشت داده شد: 1- کشت ساده سلول های اسپرماتوگونی تازه 2- سلول های اسپرماتوگونی تازه روی نانورشته PLLA 3- کشت ساده سلول های اسپرماتوگونی منجمد- ذوب شده 4- سلول های اسپرماتوگونی منجمد - ذوب شده روی نانورشته PLLA. سلولها در محیط کشت DMEM حاوی 10% FBS و در حضور ng/ml GDNF40 بمدت 2 هفته کشت داده شد. در روزهای 4، 7، 10 و 13 کشت تعداد و قطر کلونی ها بوسیله میکروسکوپ معکوس در تمامی گروهها بررسی شد. از رنگ آمیزی ایمینوفلورسنت جهت بررسی بیان نشانگر پروتئینی OCT4 در روز پنجم کشت استفاده شد. بیان ژنهای مربوط به سلولهای زاینده (PLZF, GFR?-1, VASA, ITGA6, BCL6 )با استفاده از آزمایش RT-PCR در روز چهاردهم پس از کشت در تمامی گروهها ارزیابی شد. جهت ارزیابی عملکرد سلولهای منجمد-ذوب شده، کلونیهای آن پس از 2 هفته کشت به موش بالغ نابارور پیوند زده شد. همچنین ساختار نانورشته و کلونیهای روی آن بوسیله میکروسکوپ الکترونی بررسی شد. درصد حیات سلولهای تازه پس از مراحل جداسازی و افزودن محلول انجماد به ترتیب 4/2±4/87 و 1/3±8/81 بود که پس از انجماد این میزان به طور معنی داری کاهش یافت و به 7/1±65 درصد رسید(P<0.01). تعداد کلونی های حاصل از کشت سلول های اسپرماتوگو نی روی نانورشته (گروه آزمون1 و آزمون2) در تمامی روزها در مقایسه با گروههای کنترل( کنترل 1و 2) بیشتر بود اما این اختلاف از نظر آماری معنی دار نبود. همچنین مساحت کلونیها در گروه آزمون 1 (سلول تازه بر روی نانورشته) در مقایسه با گروه کنترل (کشت ساده سلول تازه) اختالاف معنی دار نداشت ولی در گروه آزمون 2(سلول منجمد بر روی نانورشته) نسبت به گروه کنترل2(کشت ساده سلول منجمد) افزایش معنی داری داشت(P<0.05). در پایان کشت تمامی ژن های اختصاصی اسپرماتوگونی بیان شد و همچنین پیوند سلولها موفقیت آمیز بود. نتایج حاصل از این مطالعه نشاندهنده تاثیر فزآینده نانورشته PLLA در افزایش قطر و مساحت کلونیهای سلولهای منجمد-ذوب شده اسپرماتوگونی گوساله و اثبات ماهیت بنیادینگی سلولهای کشت شده می باشد.
- Abstract
- Spermatogonial stem cells (SSCs), the only adult stem cells capable of transferring genetic information to the next generation, are importance in cell biology. The most important application of these cells include: the treatment of infertility, fertility preservation of oncological patients and creation of transgenic animals. The aim of this study was to evaluate the effects of a poly L-lactic acid (PLLA) nanofiber scaffold on proliferation of frozen-thawed bovine spermatogonial stem cells. Spermatogonial cells were isolated from 3 to 5 month old bull calves testes by two steps enzymatic digestion and differential plating. The isolated spermatogonial cells were divided into four culture groups: 1) fresh spermatogonial cells, 2) fresh spermatogonial cells seeded onto PLLA 3) frozen-thawed spermatogonial cells, 4) frozen-thawed spermatogonial cells seeded onto PLLA. Cells in all groups were cultured in DMEM supplemented with 10% FCS and 40 ng/ml GDNF for 2 weeks. Such SSCs markers as OCT-4 was detected using immunoflourecent staining. Diameter and number of clusters which were determined during the culture and RT-PCR were carried out at the end of 2nd week for all culture groups. Presence of spermatogonia at the culture was determined by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for several important spermatogonial markers (PLZF, BCL6, GFR?-1, VASA, ITGA6). Stemness of these cells was evaluated by transplantation them to the testis of of Azoospermic mouse model. The viability rate of fresh cells and frozen cells after thawing were 87.4±2.4 and 65±1.7 respectively, and the difference was significant (P<0.01). In vitro culturing of spermatogonial cells on PLLA increased the number of colony in comparison with those of the control groups, however this difference wasn’t significant. Although the differences of the Surface of clusters in the fresh cell groups were not significant, culturing of frozen-thawed cells on PLLA significantly increased their surface(P?0.01). Reverse Transcription-PCR test revealed the expression of such genes as (PLZF, BCL6, GFR?-1, VASA, ITGA6) for SSCs in all of groups. Donor germ cells from were present in the recipient testis. The results of this study showed that The SSCs seeding on PLLA can increase in vitro surface(diameter) of frozen-thawed SSCs. Thereby it being concluded that a PLLA nanofiber can provide a suitable microenvironment for frozen-thawed SSCs in an in vitro culture system.
