عنوان پایان‌نامه
شناسایی بیان یکDNA
- رشته تحصیلی
- بیو تکنولوژی
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه دانشکده دامپزشکی شماره ثبت: 492 ت;کتابخانه دانشکده دامپزشکی - مخزن مرد آباد شماره ثبت: 492 ت;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 53206
- تاریخ دفاع
- ۰۷ تیر ۱۳۹۱
- دانشجو
- ابراهیم رجب زاده قطرمی
- چکیده
- در طبیعت ترکیبات مختلفی بعنوان عوامل محافظتی در بدن جانوران وجود دارد که آنها را در برابر انواع پاتوژن ها ومواد خارجی مختلف مصون می سازد. در ماهیان پوست وآبششها اولین سطوح در تماس با محیط خارجی ومیکروارگانیسم ها بوده وبه عنوان سد اولیه محافظتی مطرح میباشند لذا باید دارای سیستم های با مکانیسم های دفاعی مناسب با کارایی بالا که بتواند در مقابل این گوناگونی پاسخگوی سلامت آنها باشد دارا باشند. تحقیقات متعددی در ماهیان بر وجود انواع ترکیبات دفاعی در پوست ونیز اندامهای مختلف دلالت دارد . آنزیم لیزوزیم یکی از ترکیباتی است که طی گزارشات متعدد نه تنها از آبزیان بلکه از سایر جانوران به عنوان یک ماده دفاعی در برابر عوامل پاتوژن عنوان گشته است .لیزوزیم یکی از سه آنزیم هیدرولاز است که درسیستم دفاعی وایمنی بدن هر دو گروه جانداران خونگرم وخون سرد وحتی بی مهرگان نقش دارد. از آنجا که ماهیان در محیط طبیعی با انواع میکروارگانیسم ها در تماس هستند پوست با مکانیسم ترشح موکوس که حاوی ترکیبات محافظتی است در مقابله با آنها نقش مهمی دارد.موکوس با خاصیت افزایش ویسکوزیته وچگال کننده ونیزکیفیت شیمیایی مخصوص با ایجاد یک لایه محافظتی که ترکیبات دفاعی را حفظ وشرایط را برای دفاع در برابر پاتوژن مناسب می کند حائز اهمیت است . این پروژه باهدف جداسازی آنزیم لیزوزیم ازموکوس طبیعی ماهیان کپور معمولی وبیان آن در یک سیستم پروکاریوتی و بررسی میزان لیزوزیم نوترکیب تولید شده و ارزیابی اثر ضد باکتریایی آن بر نامه ریزی گردید . در نتایج توالی اصلی لیزوزیم نوع G در موکوس ماهی کپور معمولی مورد مطالعه دارای 555 جفت باز می باشد که با کدون آغازگر ATG شروع وبه کدون متوقف کننده TGA ختم می شود که کدکننده 185 اسید امینه و وزن ملکولی آن 20.2 کیلو دالتن می باشد میباشند. بیشترین درصد تشابه سکونس اسید های آمینه در همترازی بلاست انجام گرفته با گونه ماهی Danio rerio با 94 درصد می باشدوبعد به ترتیب با ماهی Salmo salar با 42 تا 21 درصد برحسب نوع لیزوزیم G بافتی و با Gallus gallus ، xenopus laevis وTetradon nigroviridis زیر 21 درصد تشابه می باشد.وجود جایگاه های کاتالیتیکی در سه اسید امینه ذکر شده برای فعالیت آنزیمی لیزوزیم نوع g در ماهی با توجه به آزمایش های ارزیابی باکتریایی ضروری وکفایت داردواین ویژگی با ارزیابی اثر ضد باکتریایی لیزوزیم نوترکیب بر روی باکتری میکروکوکوس دیزولیتیکوس در روش جامد آگار وروش فاز مایع تایید گردیده استدر ارزیابی فعالیت ضد باکتریایی لیزوزیم نوترکیب از دو روش جامد آگار و روش ارزیابی کدورت سنجی (اسپکتروفتومتری )استفاده گردید.بر اساس نتایج در روش جامد مشاهده گردید میزان اثر فعالیت ضد باکتریایی لیزوزیم نوع G در موکوس ماهی کپور نسبت به لیزوزیم سفیده تخم مرغ(HEWL) (لیزوزیم نوع C)استاندارد دارای زون مهاری کمتری می باشد.ژن لیزوزیم نوع Gاز سلول های موکوس ماهی کپور استخراج وتکثیر شد. این پروتئین دارای قابلیت بیان مطلوب پس ازورود به وکتور pMalc2 در میزبان پروکاریوتی TG1 می باشد.لیزوزیم G بیان شده دارای خصوصیت کاملا هیدروفیلیک است این آنزیم دارای فعالیت ضد باکتریایی مناسب با توجه به خصوصیات ساختاری در محیط های آبی ومحافظت از ماهی می باشد که از ویژگی های بارز آن نسبت به فعالیت ضد باکتریایی آن در فاز جامد می باشد.
- Abstract
- Lysozymes are key molecules of innate immunity act as non-specific innate-immunity molecules against the invasion of bacteria pathogens in fish.The aim of the present study was to amplify and express a full-length g-type lysozyme cDNA from the skin mucus of common carp (Cyprinus carpio).In this respect, the complete cDNA consisted of an open reading frame of 555 bp which encoded a protein of 185 amino acids. Regardingly, conserved and catalytic residues of this cDNA were identified which showed some similarity with Danio rerio , Salmo salar , Gallus gallus , Xenopus laevis and Tetradon nigroviridis. This Recombinant g-type lysozyme cDNA has been cloned into pMALc2x and expressed in E. coli strain TG1. The resulted recombinant protein showed lytic activity against Micrococcus lysodeikticus
