عنوان پایان‌نامه
بررسی پروتئوم آنتی ژنها
- رشته تحصیلی
- بیو تکنولوژی
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه دانشکده دامپزشکی شماره ثبت: 487 ت;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 59951;کتابخانه دانشکده دامپزشکی - مخزن مرد آباد شماره ثبت: 487 ت
- تاریخ دفاع
- ۰۷ خرداد ۱۳۹۱
- دانشجو
- محمد طاهری
- استاد راهنما
- صدیقه نبیان
- چکیده
- کنه ها از مهمترین انگلهای خارجی دامها میباشند که بواسطه خونخواری، سبب ایجاد خساراتی از جمله کاهش وزن، کمخونی و کاهش تولید میگردند. همچنین قادر به انتقال بسیاری از اجرام بیماریزا به انسان و دام میباشند. کنه بوافیلوس آنولاتوس یک کنه تک میزبانه است که از نظر انتقال اجرام بابزیا بویس، بابزیا بایژمینا و آناپلاسما مارژیناله حائز اهمیت ویژه میباشد. بررسی پروتئینهای این کنه، میتواند گامی مهم در شناخت بیشتر مولکولهای بیولوژیک باشد که برای توسعه استراتژیهای کنترلی بکار گرفته میشوند. مطالعات الکتروفورز دوبعدی پروتئینهای لارو کنه بوافیلوس آنولاتوس، سبب شناخت بیشتر پروتئوم این کنه میگردد. در مطالعه حاضر ابتدا اقدام به شناسایی پروتئینهای عصاره لارو کنه بوافیلوس آنولاتوس با استفاده از روش الکتروفورز یک بعدی و دوبعدی گردید. پروتئینهای لارو کنه با روش الکتروفورز یک بعدی و رنگآمیزی کوماسیبلو در شرائط احیائی عبارت از 6 باند پروتئینی واضح با وزنهای مولکولی 11 و 28، 33، 60، 72، 95 کیلودالتون و در شرائط غیراحیائی ، شامل 11 باند پروتئینی واضح با وزنهای مولکولی 26 و 27، 33، 48، 60، 72، 80، 85، 100، 150و بیشتر از 250 کیلودالتون بودند. همچنین بعد از انجام روش الکتروفورز و وسترن بلاتینگ دوبعدی، تعدادی نقطه پروتئینی از نظر فراوانی و ایمنیزایی انتخاب گردید. به طوریکه تعداد دو نقطه پروتئینی بر حسب غلظت بیشتر و 8 نقطه پروتئینی براساس ایمونوژن بودن از روی ژل برداشته شد و مورد آزمایشات اسپکترومتری جرمی قرار گرفتند. ترادف اسیدهای آمینه 4 نقطه از 8 نقطه پروتئینهای ایمونوژن با وزنهای مولکولی 97، 85، 43 و 39 کیلودالتون با ترادف اسیدهای آمینه ویتلوژنین و همولوگهای آن در کنه بوافیلوس میکروپولوس و درماسنتور واریابیلیس شباهت داشتند. ترادف اسید آمینه یک نقطه پروتئینی ایمونوژن با وزن مولکولی 37 کیلودالتون با ترادف اسیدهای آمینه تروپومیوزین کنه بوافیلوس میکروپولوس مشابهت داشت. دو عدد دیگر از نقاط ایمونوژن و دو عدد از نقاط غیرایمونوژن باترادفهای پروتئینی موجود در داده پایگاههای پروتئینی شباهت نداشتند. ترادف یک نقطه پروتئینی ایمونوژن با وزن مولکولی 36 کیلو دالتون با پروتئین فرضی ISCW1652 مربوط به کنه ایکسودس اسکاپولاریس شباهت داشت. همچنین در این مطالعه، به بررسی برخی از مهارکنندههای پروتئازها و پروتئازها که در بیولوژی و فیزیولوژی کنهها حائز اهمیت میباشند، با استفاده از روش زایموگرافی مستقیم و معکوس یک و دو بعدی پرداخته شد. در روش زایموگرافی معکوس نواحی با وزنهای مولکولی بین 14 تا 35 کیلودالتون با pH ایزوالکتریک متنوع مربوط به مهارکنندههای سرین پروتئازها نشان داده شدند. همچنین برخی از مهارکنندههای سرین پروتئازها توسط روش آفینیتی کروماتوگرافی و با استفاده از ستون تریپسین سفارز خالص گردید. در روش زایموگرافی مستقیم، باندهای مربوط به کاتپسینها در نواحی 21تا 65 کیلودالتون و با pH ایزوالکتریک مختلف قرار گرفتند. آنالیز پروتئوم عصاره لارو کنه بوافیلوس آنولاتوس با استفاده از پاسخ ایمنی میزبان در راستای تعیین آنتیژنهای ایمنیزا و همچنین بررسی فاکتورهای مهم در فیزیولوژی کنه میتواند منبع مناسبی جهت یافتن هدفهای بالقوه برای توسعه روشهای کنترلی و ساخت واکسن مناسب باشد و نتایج بدست آمده در این بررسی نشان میدهد که پروتئینهای ویتلوژنین و تروپومیوزین، میتوانند انتخابهای مناسی برای واکسن ضدکنهای باشند.
- Abstract
- Ticks are the most frequent ecto-parasites of animals and cause losses due to the blood sucking activity. Boophilus annulatus is one host tick that transmits the protozoans Babesia bigemina, Babesia bovis and Anaplasma marginale to cattle. Proteom analysis of Boophilus annulatus larvae will provide a resource that could be helpful for finding biologically important molecules to develop novel control strategies. In this investigation a combination of one and two diminensional electrophoresis and western blotting methods were carried out to study tick larval proteins. After one dimensional electrophoresis under non reducing conditions with coomassie blue staining, six sharp bands with molecular weights between 11 and 95 KDa and under reducing conditions eleven sharp bands with molecular weights between 26 and greater than 250 kDa were detected. After two dimensional electrophoresis numerous protein spots were observed; and some of the spots were immunogenic proteins based on the results of two dimensional western blotting. Two abundantly expressed larval proteins and eight immunogenic spots were analyzed by MALDI-TOF and MALDI-TOF-TOF mass spectrometery. Amino acid sequences of four immunogenic proteins with molecular weights of 39, 43, 85 and 97 kDa were identified as Boophilus microplus and Dermacentor variablis vitellogenin. One immunogenic spot with molecular weight of 37 kDa was matched to Boophilus microplus tropomyosin. One immunogenic spot with molecular weight of 36 kDa had a single matched peptide to hypothetical protein ISCW1652 for Ixodes scupolaris. Two other immunogenic and two abundant protein spots were not identifiable. Besides, some tick larvae protease inhibitors and proteases were studied by one and two dimensional reverse zymography and zymography. In reverse zymography, trypsin inhibitory activities were detected in 14 to 35 kDa zones. Some serin protease inhibitors were purified by affinity chromatography on trypsin-sepharose column. In zymography, transparent spots in dark gel background, distributed in 21 to 65 kDa zones, were cathepsins. The results of this investigation suggest tropomyosine and vitellogenin, could be used as possible vaccine candidates.
