عنوان پایان‌نامه
تعیین هویت مولکولی جدایه های ORT
- رشته تحصیلی
- دامپزشکی
- مقطع تحصیلی
- دکترای تخصصی
- محل دفاع
- کتابخانه دانشکده دامپزشکی شماره ثبت: 482 ت;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 52676;کتابخانه دانشکده دامپزشکی - مخزن مرد آباد شماره ثبت: 482 ت
- تاریخ دفاع
- ۱۸ اردیبهشت ۱۳۹۱
- دانشجو
- ناصر قدسیان
- استاد راهنما
- وحید کریمی
- چکیده
- اورنیتوباکتریوم رینوتراکیال (ORT) به عنوان یک عامل بیماری‌زای باکتریایی در گله‌های ماکیان و بوقلمون است. هدف از این مطالعه تعیین هویت مولکولی جدایه‌های ORTاز نمونه‌های طیور صنعتی کشور طی سال‌های 1388-1377 ارسالی به موسسه رازی بوسیله تعیین توالی و روش Eric PCR می‌باشد. بدین منظور ابتدا نمونه‌های موجود در بانک میکروبی بخش تشخیص بیماری‌های طیور موسسه رازی جهت تکثیر در محیط‌های BHI و بلاد آکار کشت داده شدند. سپس گونه آنها با استفاده از آزمون‌های بیوشیمیایی و واکنش زنجیره‌ای پلیمراز(PCR )، بر اساس تکثیر قطعه‌ای از ژن rRNA 16 S، شناسایی شد. در روش انگشت نگاری با استفاده از روش ERIC-PCR، 25 جدایه که از سال‌های مختلف و استان‌های مختلف انتخاب شده بود، تقریباً 19 باند بین 0.1 تا 2.5kb را نشان دادند و تمامی آنها در آزمون ERIC-PCR پروفایل مولکولی یکسانی را نشان دادند که بیانگر ژنوتیپ واحد آنهاست و آن بسیار شبیه ژنوتیپ A در مطالعات انجام شده توسط سایر دانشمندان بود. سپس با کمک پرایمرهای اختصاصی ژن کامل 16S rRNA، آزمون PCR دیگری راه‌اندازی گردید و قطعه حدود 1400 جفت بازی، تکثیر و تخلیص شده و توالی نوکلئوتیدی آنها مشخص گردید. همردیف کردن، مقایسه توالی‌های نوکلئوتیدی و آنالیز فیلوژنیک در برنامه‌های Bioedit و MEGA انجام شد. آنالیز فیلوژنیک جدایه‌های ORT نشان داد که نمونه‌های جدا شده در این بررسی در مقایسه با ORTهای موجود در بانک ژن، در سه دودمان(شاخه) نزدیک به هم، قرار گرفتند و تمامی 25 جدایه ایران در یک شاخه واقع شداند. تشابه صددرصد تمامی 25 جدایهORT از مناطق متفاوت کشور طی سال‌های 1388-1377، از لحاظ توالی ژن 16S rRNA با یکدیگر و همچنین تشابه زیاد(6/98 تا 100 درصد) آنها با 63 جدایه از سراسر دنیا، مشاهده گردید. بیشترین قرابت جدایه‌های مطالعه حاضر با جدایه‌های کشور آمریکا، روسیه، تایوان دیده شد. به طور کلی نتایج این بررسی نشان داد که جدایه‌های ORT ماکیان صنعتی کشور در مطالعه حاضر، از نظر ساختار مولکولی نزدیک به هم بوده و هوموژنیتی بین آنها وجود دارد و این جدایه‌ها از یک گروه کلون کوچک و نزدیک به هم منشاء گرفته‌اند. یافته‌های این تحقیق مؤید آن است که استراتژی واکسیناسیون به منظور کنترل بیماری در صنعت طیور کشور احتمالاً موفقیت‌آمیز خواهد بود.
- Abstract
- Ornithobacterium rhinotracheale (ORT) has been identified as one of the emerging respiratory bacterial pathogens in turkey and chicken flocks. The aim of this study was microbiologically isolation and identification of ORT isolates and molecularly characterization of them. Blood-enriched culture media and biochemistry tests were used for microbiologic identification. Polymerase chain reaction (PCR), Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-PCR (ERIC-PCR) fingerprinting and 16S ribosomal RNA nucleotide sequencing techniques were used for molecular identification and characterization, respectively. ORT bacteria were isolated in enriched media from the respiratory tract of broilers, breeders, and layers from several geographic zones of Iran submitted to Razi Institute during 1999-2009. Diagnosis of ORT infection has been faced some difficulties in isolation and identification of the bacterium based on the biochemical properties. A reliable identification method that can be used in routine laboratory investigations is of importance. In this study molecular detection of ORT by use of a very specific polymerase chain reaction (PCR) based on the amplification of a fragment on the 16S rRNA gene was investigated. The PCR was optimized using the primer combination OR16S-F1 and OR16S-R1, positive control of ORT bacteria, and 7 other bacteria such as Haemophilus paragallinarum and Pasteurella multocida as negative control. All samples were prepared for DNA extraction by use of phenol- chloroform method. Sixty pooled tracheal and infraorbital sinus samples from 30 broiler flocks slaughtered at an abattoir in Gazvin province were examined for presence of ORT using culture and PCR assay. A fragment of 784-bp was amplified in 5 positive known ORT samples, but not in other 7 bacteria as negative controls. 19 out of 60 original samples including 11 homogenized tracheal samples and 8 infraorbital sinus swabs, and also all 16 suspected and purified colonies identified microbiologically as ORT were positive in PCR assay. One out of 41 negative original samples in PCR test became positive through the culture. Then the propagated bacterium was confirmed in PCR. Fifteen out of 30 flocks (50%) were positive in PCR test and only one of them was negative in culture. The results showed the PCR method of this study can be used as a reliable and rapid identification of ORT in original samples suspected to ORT infection. However, it is better to use a combination of the PCR and culture in order to maximize the diagnosis of ORT infections. Six isolates of out of 14 from Gazvin province and also nineteen isolates out of 70 from some other provinces including; Markazi, Alborz, Qom, Esfahan, Guilan and Mazandaran were selected for further studies. ERIC-PCR fingerprinting showed in all of the ORT isolates approximately 19 bands between 0.1 and 2.5 kb, with 1.2 kb being the most prominent, which may indicate that this band is present in the genome in more than one copy or that the DNA fragments differ in their nucleotides only slightly. All 25 isolates of ORT tested with ERIC-PCR had a genetic profile similar to genotype A in other studies; indicating the presence of only one genotype in the ORT isolates studied. Another PCR for the 16S rRNA complete genome was set up and about 1400-bp bands were amplified and then sequenced. Multiple alignment and phylogenic analysis of DNA sequences were performed with Bioedit and MEGA programs. Phylogenic analysis of ORT isolates and 63 ORT sequences obtained from Genbank from the entire world showed high genetic similarity (98.6% - 100%) among them. The 16S rRNA sequence of these 73 ORT sequences were grouped into three genetic clusters. The Iranian isolates showed hundred percent similarity with each others. These isolates showed the most homology with ORT isolated from USA, Russia and Taiwan. Overall, these results revealed the same molecular structure and high homology among ORT isolates from commercial chicken industry of Iran. Upon the results of this study it has been concluded that these isolates are represented by a small group of closely related clones. The findings of our investigation indicated that vaccination may be a successful strategy for disease ( ornithobacteriosis) control.
