عنوان پایان‌نامه

کلونینک پروتئین غشائ سطحی تیلریا آنولاتا و تعیین ایموژنیستی آن



    دانشجو در تاریخ ۲۷ خرداد ۱۳۹۱ ، به راهنمایی ، پایان نامه با عنوان "کلونینک پروتئین غشائ سطحی تیلریا آنولاتا و تعیین ایموژنیستی آن" را دفاع نموده است.


    رشته تحصیلی
    انگل شناسی دامپزشکی
    مقطع تحصیلی
    دکتری تخصصی PhD
    محل دفاع
    کتابخانه دانشکده دامپزشکی شماره ثبت: 490 ت;کتابخانه دانشکده دامپزشکی - مخزن مرد آباد شماره ثبت: 490 ت;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 53386
    تاریخ دفاع
    ۲۷ خرداد ۱۳۹۱
    دانشجو
    نسترن سادات صدرشیرازی
    استاد راهنما
    پرویز شایان
    چکیده
    لینک فایل چکیده
    تیلریوز از بیماری های تک یاخته ای منتقله از کنه های سخت به میزبان های نشخوار کننده مانند گاو، گوسفند و بز است و موجب کاهش شدید تولیدات دامی در مناطق گرمسیر و نیمه گرمسیر دنیا می گردد. از مهمترین گونه های جنس تیلریا می توان به تیلریا آنولاتا که عامل تیلریوز گرمسیری یا تیلریوز مدیترانه ای در جمعیت گاوی است اشاره کرد. از آنجایی که تیلریوز در مناطق گرمسیر و نیمه گرمسیر دنیا از جمله ایران منجر به تلفات و خسارات اقتصادی فراوانی در میزبان های اهلی می گردد تا کنون در کشورمان مطالعات فراوانی در جهت شناسایی ابعاد گسترش این بیماری در مناطق جغرافیایی مختلف با استفاده از روش های گوناگون مولکولی و مورفولوژیک انجام گرفته است. گرچه در ایران رنگ آمیزی گیمسا در بررسی گسترش تهیه شده از خون محیطی دام آلوده و مبتلا از روش های رایج تشخیصی محسوب می شود اما با اشکالاتی همچون ناتوانی در تفریق الگوی مرفولوژیک انگل های مشابه و ضعف تشخیصی فرد آزمونگر همراه است. روش های مبتنی بر بررسی شیوع سرولوژیک به خصوص در اشکال تحت بالینی بیماری در سطح گله نیز به وفور مورد استفاده قرار گرفته اند، ولی به دلیل وجود واکنش های متقاطع امروزه روش های تشخیصی اختصاصی تر مانند PCR، Nested-PCR، PCR-RFLP و RLB مطرح گردیده اند اما با توجه به مشکلاتی همچون عدم توانایی در تفریق آلودگی ناشی از ورود طبیعی انگل و یا آلودگی ناشی از واکسن و همچنین تشخیص فاز آلودگی میزبان با روش PCR، با طراحی و اجرای موفقیت آمیز روش های مبتنی بر تشخیص سرمی انگل مانند ELISA با استفاده از پروتئین های نوترکیب انگل به عنوان آنتی ژن نشان داده شد که این روش ها از قابلیت استاندارد سازی در مناطق جغرافیایی مختلف برخوردار می باشند. یکی از بهترین پروتئین های ایمونوژن انگل تیلریا آنولاتا، پروتئین سطحی انگل ((TaSp)Theileria annulata surface protein ) می باشد. مطالعات شایان در 1998 برای اولین بار منجر به شناسایی و تهیه cDNA کد کننده بخشی از توالی پروتئین سطحی انگل تیلریا آنولاتا (TaSp) گردید. مطالعات تکمیلی انجام شده توسط Schnittger در 2002، نشان داد که این پروتئین بسیار پلی مورف در مرحله شیزونت و اسپوروزوایت انگل بیان می شود. با توجه به مطالعات انجام شده در استفاده از پروتئین نوترکیب TaSp در شناسایی آلودگی تیلریا آنولاتا و با در نظر گرفتن مطالعات پراکنده صورت گرفته در شناسایی توالی نوکلئوتیدی کد کننده TaSp در نواحی جغرافیایی بوئین زهرا و کرج، در مطالعه حاضر شناسایی و بررسی پلی مورفیسم در توالی نوکلئوتیدی کد کننده پروتئین سطحی (TaSp) در ایزوله تیلریا آنولاتا در گاو های ارجاعی به بیمارستان دامپزشکی محمد شهر در حومه کرج و همچنین بیان ژنتیکی توالی نوکلئوتیدی کد کننده TaSp ، تهیه و خالص سازی پروتئین نوترکیب TaSp و همچنین بررسی قابلیت تحریک کنندگی این پروتئین در بر انگیختگی سیستم ایمنی میزبان انجام گرفت. توالی مورد مطالعه در این بررسی در بانک جهانی ژنتیک تحت شماره JQ003240 ثبت گردید. پس از انجام تعیین توالی نوکلئوتیدی به روشSanger در شرکت کوثر و مقایسه توالی به دست آمده با توالی های موجود در بانک ژنتیک به تحت شماره های T. annulata TaA 288 Ankara (GenBank ID: AJ316249.1)، T. sp. China I (GenBank ID: AY274329.1)،sp. China (GenBank ID: DQ120058.1) T. و سه توالی TaSp مربوط به ایزوله های جدا شده از ناحیه بوین زهرا و کرج تحت نام های T. annulata Karaj (GenBank ID: EF092920.1)، T. annulata Boein-Zahra/1,2 (GenBank ID: EF092921.1 and EF092922.1) نشان داد که ایزوله مورد مطالعه در این بررسی به ترتیب دارای 94% ، 94%، 92% ، 92% ، 94% و 93% مشابهت نوکلئوتیدی با توالی های ذکر شده در بالا بود. باید توجه داشت که دو ایزوله بوئین زهرا دارای 99% مشابهت نوکلئوتیدی با یکدیگر و 94% مشابهت نوکلئوتیدی با توالی ایزوله کرج بودند. همچنین توالی ایزوله مورد مطالعه دارای 90% مشابهت با توالی مربوط به تیلریا لستوکاردی ایزوله فارس ثبت شده در بانک ژنتیک تحت شمارهT. lestoquardi (GenBank ID: AY274335.1) بود. مهمترین نکته مشاهده 12 نوکلئوتید از موقعیت نوکلئوتید شماره 66 تا 78 (نوکلئوتید شماره 378 از نوکلئوتید ابتدایی در توالی کامل نوکلئوتیدی کد کننده پروتئین سطحی تا نوکلئوتید شماره 390) بود که این 12 نوکلئوتید تنها در توالی ایزوله مورد بررسی (JQ003240) دیده شدند و در هیچ یک از شش توالی مورد مقایسه مشاهده نشد. باید توجه داشت که توالی ایزوله مورد مطالعه دارای 4 اسید آمینه در کدون 59 تا 62(SEQT) بود که تنها در پروتئین نوترکیب مورد مطالعه دیده شدند و در سایر توالی های مورد مقایسه ذکر شده در بالا دیده نشدند. پس از بررسی مقایسه ای مشابهت نوکلئوتیدی کد کننده پروتئین سطحی تیلریا لستوکاردی ایزوله فارس (AY274335.1) با توالی های ثبت شده در بانک ژنتیک، مشخص شد که این توالی با دو توالی ناحیه ایزوله زابل (Ef092923.1) و ایزوله مورد استفاده در واکسن تیلریوز گوسفندی –بزی EF092924.1))دارای 99% مشابهت نوکلئوتیدی بود می باشد، ، همچنین در مقایسه توالی های اسید آمینه ای ثبت شده تحت شماره های AAP36993.1، CAC87576.1، AAZ30365.1 و AAP36999.1 با توالی آمینواسیدی مربوط به پروتئین نوترکیب مورد مطالعه ، به ترتیب 94%، 94%، 88% و 68% تشابه دیده شد. همچنین توالی اسید آمینه ای ایزوله مورد مطالعه به ترتیب دارای 91 % و 89% و 89% مشابهت آمینو اسیدی با توالی امینو اسیدی مربوط به بوئین زهرا 2 و 1 تحت شماره های ثبت شده ABL10303.1 وABL10302.1 و همچنین ABL10301.1 مربوط به ایزوله کرج بود. سپس توالی ایزوله مورد مطالعه برای تولید پروتئین نوترکیب TaSp، در وکتور بیانی pQE-32 کلون شد. پس از بیان و تولید TaSp در باکتری E. coli سویه DH5-? ، پروتئین TaSp با استفاده از ستون های استخراج پروتئین های دارای توالی هیستیدینیHistidin Tag ، (Qiagen Germany) Ni-NTA Spin، خالص سازی شد و پس از بررسی با روش SDS-PAGE، بر روی غشا نیتروسلولزی منتقل شد و با استفاده از سرم گاو مبتلا به تیلریوز مورد شناسایی ایمنی به روش western blot قرار گرفت. پس از اطمینان از قابل شناسایی بودن TaSp توسط آنتی بادی پلی کلونال ضد تیلریا، این پروتئین از داخل ژل آکریلامید مورد خالص سازی قرار گرفت و برای به دست آوردن آنتی بادی اختصاصی علیه پروتئین نوترکیب TaSp، به خرگوش به صورت زیر جلدی (به سه یادآور) تزریق شد. با روش western blot، از تولید آنتی بادی پلی کلونال اختصاصی علیه پروتئین نوترکیب TaSp اطمینان حاصل شد. سپس با استفاده از آنتی بادی پلی کلونال ضد تیلریا گرفته شده از دو گاو مبتلا به تیلریوز، شناسایی پروتئین TaSp در لیزات باکتریایی حاوی پروتئین به روش western blot انجام شد و از سرم ضد TaSp گرفته شده از خرگوش، به عنوان سرم کنترل مثبت استفاده شد . نتیجه آن که می توان از پروتئین نوترکیب TaSp به منظور طراحی تست های تشخیصی ELISA ، برای تشخیص تیلریا آنولاتا در دام های آلوده به طور وسیع در سطح گله استفاده نمود. همچنین جهت تعیین نقش این پروتئین در برهمکنش انگل-میزبان و یا مطالعات راهبردی جهت تولید واکسن در بررسی های آینده می تواند مد نظر واقع شود.
    Abstract
    Background: Theileriosis is severe and often fatal protozoan tick-borne disease of ruminants worldwide. Tropical or Mediterranean Theileriosis caused by the protozoan parasite T. annulata, is distributed in the middle east and regions of southern Europe, North Africa, India and China. Diagnosis can be performed using Giemsa staining method. This method belongs to the most used diagnostic methods in Iran. Since the Giemsa staining method is unspecific and can be accompanied with some technical problems and in some cases needs special experiences especially by low parasitaemia, can not be used as a reliable method for diagnosis of Theileriosis. PCR is useful method for the detection of Theileria annulata agent in carrier cattle even where parasitaemia may be low . It is also the most specific method for differential diagnosis of piroplasms using different sources of blood samples, including already stained blood smears .The only disadvantage of this method is that, the PCR technique can not differentiate between the acute phase, latency period or carrier animals. The indirect fluorescence antibody test (IFAT) had more sensitivity than the Giemsa staining method for detection of T. annulata in cattle. One of the disadvantages of the diagnostic methods like IFAT based on the polyclonal antibody against the whole antigens prepared from Theileria agent is the cross-reactivity among the Theileria species. Production of recombinant proteins in recent years led to the development of new enzyme-linked immunosorbant assays (ELISA) for detection of several important Theileria species such as T. parva and T. annulata . The characterization of T. annulata surface protein TaSp and its followed application in indirect ELISA makes TaSp protein as a serious candidate molecule for developing of detecting and/or controlling tools. TaSp is a membrane protein that contains three membrane domains, with a large segment containing a polymorphic region facing the cytoplasm of the host cell. Since the tropical Theileriosis caused annually high economical losses in Iran, it is important to perform epidemiological studies dealing with the prevalence of infection, which needs a reliable diagnostic tool for screening of sera. The aim of this study was to characterize the TaSp protein in the T. annulata isolate from Iran and compare it with the known corresponding sequences registered in GenBank, production and evaluation of serological responses to recombinant TaSp in naturally infected cattle. Methods: The RNA prepared from T. annulata infected cells was used to produce SMART-DS-cDNA. The Double strand cDNA was then amplified with primers derived from TaSp mRNA sequences. The PCR product was cloned in pTZ57R/T vector, sequenced and registered under accession no. JQ003240 in GenBank. Then, the TaSp encoding gene was cloned in pQE-32 vector, and TaSp protein was expressed using IPTG in E. coli host strain DH5?. SDS-PAGE done for detection of recombinant protein and TaSp recombinant protein was then extracted and injected SC to Rabbit for preparation of polyclonal anti-TaSp specific antibodies as the positive serum control. Western blot analysis confirmed that the TaSp recombinant protein induces strong immunologic response in infected host and is detectable with serological immunological methods. Results: The sequence analysis showed 90%-94% nucleotide sequence identity and 68%-94% amino acid homology to the corresponding sequences of TaSp gene by T. annulata, T. sp. china I, T. sp. china and T. lestoquardi and three T. annulata reported from Iran respectively. Interestingly, the sequence analysis also showed small nucleotide sequence region near the 5` end in which the presented TaSp protein differed very strongly from the other known TaSp sequences. For the preparation of the recombinant protein, the cDNA was cloned in pQE-32 vector, the recombinant protein was prepared and assayed by Theileria infected bovine serum. Conclusion: The polymorphism in TaSp gene could be detected in intra- as well as inter species. The different characterized TaSp proteins had a common identical region, which may be helpful for development of broad band vaccine based on the recombinant proteins. The polymorphism in this gene, make this protein also interesting for the diagnostic purposes.