عنوان پایان‌نامه
کلونینک و تولید پروتئین P۲۳ کریپتوسپوریدیوم پاروم در PQE و آنالیز آن در جداسازی انگل از طریق کروماتوگرافی
- رشته تحصیلی
- انگل شناسی دامپزشکی
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه دانشکده دامپزشکی شماره ثبت: 529 ت;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 67333;کتابخانه دانشکده دامپزشکی - مخزن مرد آباد شماره ثبت: 529 ت
- تاریخ دفاع
- ۱۴ اسفند ۱۳۹۱
- دانشجو
- زهرا امیدیان
- استاد راهنما
- پرویز شایان
- چکیده
- کریپتوسپوریدیوم پارووم تک یاخته ای کوکسیدیایی است که باعث اسهال در انسان های دچار نقص ایمنی و حیوانات تازه متولد شده می‌گردد. میلیاردها ا ووسیست کریپتوسپوریدیوم پارووم از گوساله‌های آلوده دفع شده و محیط زیست را آلوده می‌کند. شدت بیماری بستگی به وضعیت ایمنی فرد دارد. اووسیست‌های کریپتوسپوریدیوم پارووم به شرایط محیطی و ضد عفونی کننده‌های رایج بسیار مقاوم می‌باشند و درمان مناسبی علیه این تک یاخته در دسترس نمی‌باشد. در مطالعه حاضر، از پروتئین نوترکیب 23p به منظور جداسازی و تشخیص اووسیست کریپتوسپوریدیوم پارووم استفاده شد. 23p گلیکوپروتئینی متعلق به خانواده‌ای از پروتئین‌ها با وزن 27 -23 کیلو دالتون می باشد و در مراحل مختلف زندگی انگل بیان می شود. اووسیست‌های کریپتوسپوریدیوم از گوساله‌هایی که به طور طبیعی آلوده شده بودند جدا سازی و تخلیص گردید و به وسیله روش Nested PCR گونه پارووم مشخص گردید. برای به دست آوردن پروتئین نوترکیب 23p ، از اووسیست‌های کریپتوسپوریدیوم پارووم mRNA استخراج و سپس cDNA سنتز گردید PCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن 23p صورت گرفت. تعیین توالی محصول PCR شباهت 100? به توالی 23p ثبت شده در بانک ژن را نشان داد. ژن 23p در وکتور PQE-32 کلون و پروتئین نوترکیب 23p بیان گردید.آزمایش وسترن بلات نشان داد که پروتئین نوترکیب 23p توسط سرم مثبت کریپتوسپوریدیوم پارووم شناسایی گردید. آزمایش دات بلات نشان داد که آنتی بادی بر علیه 23p در رقت 1:200 تا 1:1000 در سرم خرگوش ایمن شده با پروتئین نوترکیب 23p قابل تشخیص بود. آنتی بادی 23p تهیه شده در خرگوش به سفاروز B 4 متصل شده و برای جداسازی اووسیست‌ها مورد استفاده قرار گرفت. نتایج نشان داد که ستون تهیه شده ، قادر به اتصال اختصاصی اووسیست‌ها می‌باشد. این نتایج نشان داد که امکان طراحی روشی جدید برای جداسازی اووسیست‌های کریپتوسپوریدیوم پارووم مبتنی بر آنتی‌بادی ضد 23p وجود دارد.
- Abstract
- Cryptosporidium parvum is a coccidian protozoan that causes diarrhea in immunocompromised humans and newborn animals. Billions oocysts of C. parvum can be released from the infected calves and can contaminate environment. The severity of the disease depends on immunological status of the individual. Oocysts of Cryptosporidium are extremely resistance to many environmental stresses and no effective disinfectant and curative agent against this organism is available. In our study, recombinant C. parvum p23 was prepared for application in isolation and detection of cryptosporidium oocysts. P23 is a glycoprotein belongs to a family of protein with 23-27 kDa and is believed to be expressed in the different life stages of the parasite. We isolated Cryptosporidium oocysts from the naturally infected calves. The oocysts were then purified and characterized as C. parvum by nested PCR. To obtain the recombinant P23 protein, we isolated the mRNA from oocyst of C. parvum, and synthesized the cDNA. The cDNA was then amplified using specific primers for P23 gene. Sequencing of PCR product showed 100% homology to the known P23 sequences in GenBank. The double strand P23-cDNA was then cloned in PQE-32 expression vector and P23-recombinant protein was prepared. Western blot analysis of recombinant P23 showed that it could be recognized by the positive C. parvum serum. The dot blot analysis showed that antibody against P23 was detectable at 1:200 to 1:1000 dilutions in serum of immunized rabbit with recombinant P23. The antibody prepared in rabbit against p23 was first analyzed by dot blot analysis and then bound to the sepharose 4B and used for isolation of oocysts. The results showed that the prepared column was able to bind specific only the oocystes. These results showed that it could be possible to design a new method for isolation of C. parvum oocysts based on anti P23 antibody .
