عنوان پایان‌نامه
بررسی مولکولی انگل داکتیکوژیروس آبشش ماهی گلدفیش با روشPCR
- رشته تحصیلی
- بهداشت آبزیان
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه دانشکده دامپزشکی شماره ثبت: 417 ت;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 46297;کتابخانه دانشکده دامپزشکی - مخزن مرد آباد شماره ثبت: 417 ت
- تاریخ دفاع
- ۱۵ آبان ۱۳۸۹
- دانشجو
- زهره مژدگانلو
- استاد راهنما
- حسینعلی ابراهیم زاده موسوی, پرویز شایان
- چکیده
- داکتیلوژیروس ها یکی از مونوژن ها است که به عنوان انگل خارجی آبشش، چندین گونه از ماهیان مانند کپور وحوض را آلوده می کنند. معمولی ترین روش شناسایی این انگل ها با بررسی میکروسکوپی لاملاهای آبشش است که روشی وقت گیر و دشوار می باشد. در مقابل به کارگیری تکنیک های مولکولی روشی اختصاصی وحساس تر جهت تشخیص انگل ها محسوب می شوند. در این مطالعه، روش PCR و تعیین توالی برای تشخیص گونه های داکتیلوژیروس استفاده گردید. بدین منظور پرایمرهایی از ناحیه ITS-1 ژن RNAریبوزومی انگل برای تکثیر DNAگونه های مختلف انگل های داکتیلوژیروس طراحی گردید. سپس69 عدد انگل داکتیلوژیروس از 100 ماهی حوض به روشهای میکروسکوپی جدا گردید و به دنبال تعیین گونه انگل با روش میکروسکوپی، استخراج DNA از هر یک از انگل ها انجام شد. به منظور ارزیابی توانایی PCR طراحی شده برای تشخیص انگل در بافت آبشش، استخراج DNA از انگل ها به همراه بافت آبشش نیز انجام گردید. به علاوه PCR بافت آبشش عاری از انگل، به عنوان کنترل منفی انجام گردید. در مرحله بعد محصولPCR تخلیص و تعیین توالی گردید. اندازه محصول PCR برای گونه های مختلف داکتیلوژیروس 532 جفت باز بود. بدنبال تکثیر DNA تخلیص شده از بافت آبشش حاوی انگل داکتیلوژیروس نیز محصول PCR با اندازه 532 جفت باز مشاهده گردید اما هیچ گونه محصولی به دنبال PCR بافت آبشش عاری از انگل مشاهده نگردید. بدنبال مقایسه توالی نوکلئوتیدهای محصولاتPCR با توالی نوکلئوتیدهای موجود در GenBank، 100 درصد تشابه با دو گونه داکتیلوژیروس واستاتور و داکتیلوژیروس دولکایتی مشاهده گردید. نتایج بدست آمده از روش ملکولی کاملاً مشابه نتایج حاصل از بررسی های میکروسکوپی بود. بنابراین، نتایج حاصل نشان می دهد که امکان استفاده از روش های مبتنی بر PCR، برای شناسایی ماهیان آلوده به داکتیلوژیروس از طریق استخراج DNA به طور مستقیم از کل بافت آبشش آلوده به داکتیلوژیروس وجود دارد.
- Abstract
- Dactylogyrus spp. are Monogenean found mostly as ectoparasites of the gills of several species including carp and goldfish. The common method used to identify these parasites consists of microscopic observation of gill lamellae which is often time consuming and difficult in handling. In contrast, the application of molecular techniques provides specific and sensitive detection of parasites. In the present study, a PCR technique and sequencing was used for detection of Dactylogyrus spp. For this aim specific common primers were designed from rRNA gene to amplify the ITS-1 region from the Dactylogyrus spp.69 Dactylogyrus parasites were identified in 100 fishes. Dactylogyrus worms were collected from 100 goldfishes and characterized using dissection microscope. All characterized single worms were then used for DNA extraction. To evaluate the developed PCR, a single parasite was added to a parasite free gill and used as a source for DNA extraction. A free gill sample, taken from a healthy fish, was used also as negative control. The results showed an expected PCR product of 532-nucleotide in length by single parasite and single parasite added to a parasite free gill. The DNA extracted from free parasite gill tissue revealed no PCR product as expected.Subsequently, the PCR products were purified and sequenced Comparison of the nucleotide sequence of the PCR products with the corresponding registered nucleotide sequences in the GenBank, showed 100 percent homology with two Dactylogyrus species namely Dactylogyrus vastator and Dactylogyrus dulkeiti . The results obtained from the sequence analyses were compatible with the results achieved by microscopic analysis. The results showed that it is possible to develop a sensitive and precise method based on PCR for detection of different Dactylogyrus spp. in fish by the DNA extracted directly from whole gill.
