عنوان پایان‌نامه
بررسی فعالیت ضد قارچی قارچهای اندوفیت جدا شده از برخی گیاهان؛ بهبود کارآیی استرین منتخب به روش امتزاج پروتوپلاستها
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی شماره ثبت: 7227;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 78937;کتابخانه مرکزی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی شماره ثبت: 7227;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 78937
- تاریخ دفاع
- ۰۶ بهمن ۱۳۹۵
- دانشجو
- حسین کاری دولت آباد
- استاد راهنما
- محمد جوان نیکخواه
- چکیده
- گیاه پسته به عنوان یکی از گیاهان پربازده و دارای مقاومت زیاد در برابر خشکی و شوری، نقش قابل توجهی در Aspergillus وضعیت اجتماعی و اقتصادی کشاورزان مناطق خشک و نیمه خشک دارد. آلودگی میوه پسته به قارچ صادرات این محصول ارزشمند را تحت تاثیر قرار داده است. به دلیل تأثیر مضر مصرف آفتکشها مانند flavus آلودگی زیست محیطی و به خطر افتادن سلامتی انسان، حیوانات و مسئله مقاومت بیمارگرها به آفتکشها، اتخاذ راهکارهای مدیریتی مناسب از قبیل استفاده از قارچهای اندوفیت که چنین خطراتی را نداشته باشند، ضروری است. به منظور شناسایی قارچهای اندوفیت درختان پسته، از چهار رقم اوحدی، کله قوچی، اکبری و احمدآقایی درختان سالم پسته از 13 روستای شهرستان رفسنجان استان کرمان نمونه برداری انجام گرفت. در مجموع، 64 نمونه گیاهی شامل برگ و میوه جمع آوری شد. جداسازی قارچها بر اساس روشهای متداول جداسازی قارچهای اندوفیت انجام ITS گرفت. در نهایت 614 جدایه قارچی بهدست آمد که بر اساس ویژگیهای ریختشناسی و توالییابی ناحیه - 1 40 آرایه شناسایی شدند. تعداد 37 آرایه تا سطح گونه شناسایی شدند. در این تحقیق، 21 جدایه قارچ- ،5.8S-ITS2 های اندوفیت جدا شده از مو و سرخدار معمولی موجود در بخش بیماری شناسی گیاهی، گروه گیاه پزشکی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران نیز استفاده شدند. غربالگری اولیه جدایه های قارچ های اندوفیت علیه به روش کشت متقابل انجام Sclerotinia sclerotiorum و Rhizoctonia solani ،A. flavus بیمارگرهای گرفت و 19 جدایه انتخاب شدند. غربالگری ثانویه جدایههای منتخب با ارزیابی حل کنندگی فسفات معدنی، تولید سیدروفور، کیتیناز و فعالیت ضد قارچی با روشهای کشت متقابل و اختلاط در محیط کشت انجام گرفت که دو برای امتزاج T. harzianum TH 10-2- و 2 Trichoderma harzianum TH 5-1- استرین والدی 2 پروتوپلاست انتخاب شدند. بهترین زمان انکوباسیون برای آزادسازی پروتوپلاستها برای هر دو والد سه ساعت تعیین شد و بیشترین تولید میزان پروتوپلاست با غلظت شش میلیگرم در میلیلیتر آنزیم تخریب کننده دیواره 5 درصد با / 0 مولار کلرید پتاسیم حاصل شد. بیشترین نرخ امتزاج پروتوپلاست به مقدار 7 / سلولی گلوکانکس با 6 40 درصد پلی اتیلن گلیکول حاصل شد. مقایسه میزان کیتیناز تولیدی و ارزیابی فعالیت ضدقارچی امتزاج یافته ها و به طور معنی داری Fu والدین به روشهای کشت متقابل و اختلاط در محیط کشت صورت گرفت. امتزاجیافته 3 و استرینهای والدی به روش Fu باعث کنترل بیمارگرها شد. جداسازی و خالص سازی ترکیبات تولیدی امتزاج یافته 3 و Fr کروماتوگرافی لایه نازک مقدماتی انجام شد. بعد از بررسی فعالیت ضد قارچی بخشهای جدا شده، دو بخش 5 انتخاب شدند که به دستگاه کروماتوگرافی مایع- طیف سنج جرمی Fu استرینهای والدی و امتزاج یافته 3 Fr2Fr2 نشان داد، ترکیب اسید کریزوفانیک شناسایی A. flavus که بیشترین تاثیر را علیه Fr تزریق گردیدند. در بخش 5 نشان S. sclerotiorum و R. solani که بیشترین درصد بازداری رشد را در بیمارگرهای Fr2Fr شد و در بخش 2 باعث افزایش T. harzianum داد، ترکیب هارزیانوپیریدون شناسایی گردید. در مجموع، امتزاج پروتوپلاست در گونه میشود. S. sclerotiorum و R. solani ،A. flavus فعالیت کیتینازی و فعالیت ضدقارچی علیه بیمارگرهای S. sclerotiorum و R. solani ،A. flavus می شود.
- Abstract
- The pistachio, as one of the highest yielding crops with a high tolerance for drought conditions and excessive salinity, has a prominent role in farmers’ social and economic situation in arid and semi-arid regions. Exportation of this valuable product is affected by aflatoxin contamination. Due to the detrimental effects of pesticides such as environmental pollution, concerns about human and animal health, and pathogen resistance to pesticides, adapting suitable alternatives like endophytic fungi which have none of these dangerous effects would be necessary. In order to identify endophytic fungi from pistachios, samples were taken from healthy trees of Ohadi, Kale Ghochi, Akbari and Ahmad Aghaei cultivars from 13 villages of Rafsanjan in Kerman province, Iran. A total of 64 plant samples, including leaves and fruits, were collected. Fungal isolation was done in accordance with standard isolation methods for fungal endophytes. Ultimately, 614 fungal isolates were obtained and 40 taxa were identified based on morphological characteristics and ITS sequencing region. Thirty-seven taxa were identified at the species level. In the current experiment, 21 available endophytic fungi from both grapevines and common yew plants were also taken from the Plant Pathology Department, Plant Protection, College of Agriculture and Natural Resources, University of Tehran, Iran. Primary screening of endophytic fungi isolates against Aspergillus flavus, Rhizoctonia solani and Sclerotinia sclerotiorum were performed based on the dual culture method and 19 isolates were chosen. Secondary screening of the selected isolates was performed with the assessment of inorganic phosphate solubilization, Siderophore, Chitinase production, and antifungal activity based on the dual culture and mixed-medium methods. Eventually, two parental strains of Trichoderma harzianum TH 5-1-2 and T. harzianum TH 10-2-2 were chosen for protoplast fusion. The best incubation time for the release of protoplasts from both parental strains was determined to be 3 hours. The maximum protoplast yield was gained with a concentration of 6 mg per ml of glucanex cell wall degrading enzyme using 0.6 M KCL. The highest protoplast fusion rate was achieved at 5.7 percent with 40 percent of Polyethylene glycol (PEG). The amount of produced chitinase and antifungal activity based on dual culture and mixed-medium methods in parents and fusants were compared. The pathogens were significantly controlled by Fu3 fusant. Isolation and purification of the generated compounds from Fu3 fusant and parental strains were done based on the preparative thin layer chromatogarphy method. After an antifungal activity assessment of isolated fractions, Fr5 and Fr2Fr2 fractions from parental strains and Fu3 fusant were chosen and injected into LC-MS. The Fr5 fraction that showed the highest effect against A. flavus, chrysophanic acid compound was identified. In Fr2Fr2 fraction that showed the highest inhibition growth rate of R. solani and S. sclerotiorum, harzianopyridone compound was identified. In total, the fusion of the protoplasts in T. harzianum causes an increase of chitinase activity and antifungal activity against A. flavus, R. solani and S. sclerotiorum. Key words: Pistachio, Screening, Trichoderma, Biocontrol, Protoplast fusion
