عنوان پایان‌نامه
ژن رسانی هدفمند وابسته به مگالین با استفاده از پلی پلکس های مبتنی بر PEI-اولیگوکاتیون به سلول‌های بیان کننده مگالین در شرایط برون تنی و درون تنی
- رشته تحصیلی
- نانوبیوتکنولوژی
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه دانشکده علوم و فنون نوین شماره ثبت: 657;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 81129;کتابخانه دانشکده علوم و فنون نوین شماره ثبت: 657;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 81129
- تاریخ دفاع
- ۲۶ تیر ۱۳۹۶
- دانشجو
- فاطمه عروجعلیان
- استاد راهنما
- علی حسین رضایان قیه باشی
- چکیده
- امروزه حامل های غیر ویروسی توجه زیادی را به خود جلب کرده است چون آنها در مقایسه با حامل های ویروسی به سادگی تهیه می شوند، نسبتا ایمن بوده و به آسانی اصلاح می گردند. سیستم های ژن رسانی هدفمند به کلیه یک تکنولوژی امیدوار کننده به منظور بهبود اثر بخشی داروها در درمان بیماری های کلیوی است. به منظور توسعه یک سیستم ژن رسانی هدفمند به کلیه، در این پژوهش ترکیب کنژوگه پلی آمین-PEI با استفاده از دو آمینوگلیکوزیدها (جنتامایسین و نئومایسین) و پلی میکسین B به عنوان لیگاند سنتز گردید و کارایی هدفگیری بالقوه آن مورد بررسی قرار گرفت. بعد از اینکهPEI25 یاPEI10 با آمینوگلیکوزیدها و پلی میکسین B از طریق واکنش آمیداسیون پیوندگردید، aminoglycoside-carboxyalkylated-PEIs و یا نانوپلکس اصلاح شده polymyxin-PEI /DNA از طریق جاذبه الکترواستاتیک بین پلیمرهای کاتیونی و پلاسمیدEGFP تولید شدند. سپس خواص کنژوگه ها از جمله اندازه ذره، چگالی بار سطحی، توانایی متراکم نمودنDNA، ظرفیت بافری و سمیت سلولی مورد بررسی قرار گرفت. در بخش اول این تحقیق پلی پلکس آماده شده از طریق برهمکنش الکترواستاتیک بین aminoglycoside-carboxyalkylated-PEIs و پلاسمید (EGFP) که پروتئین حاصل از بیان این پلاسمید که فلورسنت سبز ساطع می کند، دارای اندازه مناسب در دامنه143-173 نانومتر بود. پتانسیل این پلی پلکس ها در هدف قرار دادن رده های سلولیHK-2 و MDCK که رده های سلولی بیان کننده مگالین (یک گیرنده که در اندوسیتوز گروههای مختلف لیگاندها از جمله آنتی بیوتیکهای آمینوگلیکوزید و پلی میکسین مداخله می کند) را در سطح خود بیان می کنند، مورد بررسی قرار گرفت. Aminoglycoside-carboxyalkylated-PEIs به طور معنی داری راندمان ترنسفکشن ژن EGFP در سلول های HK-2 را تقریبا 13 برابر برای aminoglycoside-carboxyalkylated- PEI 25 و تقریبا 7 برابر برای Aminoglycoside-carboxyalkylated- PEI 10 نسبت به PEIs بدون آمینوگلیکوزید افزایش داد. راندمان ترنسفکشن پلی پلکس ها وابسته به نسبت وزنی لیگاندهای آمینوگلیکوزید در حامل بود. در حضور غلظت های مختلف آلبومین سرم انسانی، که با مگالین رقابت میکنند ترنسفکشن وابسته به aminoglycoside-carboxyalkylated-PEI تا حد ابتدایی کاهش یافت. نتایج دیگر بدست آمده نشان دادند که اندازه متوسط polymyxin- PEI 25 اصلاح شده در دامنه 143-180 نانومتر و Polymyxin-PEI10 اصلاح نشده در دامنه 115-194 نانومتر بود. تصاویر AFM نشان دادند که کمپلکس های بدست آمده کروی و در ابعاد نانو هستند. با افزایش درصد پیوند پلی میکسین B ظرفیت بافری هر دو PEI10 و PEI25 افزایش یافت. بررسی های درون شیشه ای (in vitro) نشان داد که کنژوگه های polymyxin-PEI اصلاح شده بطور قابل توجهی راندمان ترنسفکشن ژن به سلول های کلیه را بهبود می بخشید. راندمان ترنسفکشن این پلی پلکس ها وابسته به نسبت وزنی لیگاند در فرمولاسیون بود (به ترتیب تقریبا 12 و 8 برابر افزایش برای PEI25 و PEI10) و به طور قابل توجهی بالاتر از نانوذرات PEIs/DNA اصلاح نشده بود. این نتایج نشان می دهد که نانوذرات polyamine- PEIs /DNA بطور موثر می تواند به سلول های کلیه بیان کننده مگالین را مورد هدف قرار دهد و راندمان ترنسفکشن را بهبود ببخشد و سمیت سلولی کمی هم در شرایط in vitro و هم در شرایط in vivo نشان می دهد. مطالعات بر روی حیوانات in vivo نتایج in vitro را تایید کرد. بنابراین، چنین کنژوگه هایی می توانند به عنوان یک ناقل غیر ویروسی درمان کننده ایمن و کارآمد برای بیماریهای کلیه در نظر گرفته شوند.
- Abstract
- Non-viral vectors have attracted great interest, as they are simple to prepare, easy to modify and relatively safe, compared to viral vectors. Kidney-targeted gene delivery systems depict a promising technology to improve drug efficacy in renal diseases treatments. In order to develop a novel kidney-targeted gene delivery system, we synthesized polyamine-PEI conjugates using two aminoglycosides (gentamicin and neomycin) and polymyxin B as ligand and investigated their potential targeting efficiency. After grafting either PEI25 kDa or PEI10 with the aminoglycosides and polymyxin B through amidation reaction, the aminoglycoside-carboxyalkylated-PEIs and/or modified-polymyxin-PEI /DNA-nanoplexes were produced via electrostatic attraction between the cationic polymers and EGFP plasmid. The properties of modified polymers including size, surface charge density, DNA condensation ability, buffering capacity and cytotoxicity were evaluated. Polyplexes prepared by electrostatic interaction between aminoglycoside-carboxyalkylated-PEIs and enhanced green fluorescent protein-expressing (EGFP) plasmid DNA had appropriate nano-scale size (143 - 173). Their targeting potential was investigated in cultured HK-2 immortalized human cortex/proximal tubule kidney epithelial cells, and MDCK cells which expresse megalin, a scavenger receptor that mediates endocytosis of a diverse group of ligands, including aminoglycoside antibiotics. Aminoglycoside-carboxyalkylated-PEIs significantly increased EGFP gene transfection efficiency in HK-2 cells by ~13-fold for aminoglycoside-carboxyalkylated- PEI25 and ~7-fold increase for aminoglycoside-carboxyalkylated-PEI10 relative to the corresponding PEIs without aminoglycosides. The transfection efficiency of polyplexes was dependent on the weight ratio of aminoglycoside-containing ligand in the carrier. In the presence of a range of concentrations of human serum albumin, which competes for megalin binding, aminoglycoside-carboxyalkylated-PEI-mediated transfection was reduced to background levels. Furthermore results revealed that the average size of -modified-polymyxin- PEI25 was about 143-180 nm and for modified-polymyxin-PEI10 was 115-194 nm. The zeta potentials were in the range of 16.4±1.87 to 23.43±1.25 mV and 11.3±1.4 to 19.3±2.1 mV for conjugates based on PEI25 and PEI10, respectively. The AFM images revealed that the complexes were spherical and nano-sized at C/P ratio of 4. The buffering capacity of both PEI10 and PEI25 increased as the percentage of polymyxin B grafting increased. In vitro study demonstrated that modified-polymyxin-PEI conjugates could remarkably improve the gene transfection efficiency to kidney cells. The transfection efficiency of the polyplexes was dependent on the weight ratio of ligand in the formulation (~12 and 8 fold increase for PEI25 and PEI10, respectively) and was significantly higher than that of unmodified PEIs/DNA nanoparticles. These results suggest that polyamine-PEIs /DNA nanoparticles can effectively target megalin-expressing kidney cells and show improved transfection efficiency and low cytotoxicity in In vitro and In vivo studies. Animal studies (in vivo) confirmed the in vitro studies. Thus, these conjugates can be considered as a safe and efficient non-viral therapeutic therapy vector for kidney diseases.
