عنوان پایان‌نامه
تهیه و ارزیابی عملکرد دانه های آگارز اصلاح شده به عنوان بستر کروماتوگرافی تمایلی برای جداسازی آلبومین انسانی
- رشته تحصیلی
- مهندسی شیمی- بیوتکنولوژی
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه پردیس یک فنی شماره ثبت: 1863.;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 81518;کتابخانه پردیس یک فنی شماره ثبت: 1863.;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 81518
- تاریخ دفاع
- ۲۷ فروردین ۱۳۹۶
- دانشجو
- سحر امیری
- استاد راهنما
- محمدرضا مهرنیا
- چکیده
- هدف از این پژوهش ساخت چهار نمونه دانه های آگارز اصلاح شده به عنوان جاذب تمایلی با قابلیت استفاده در ستون کروماتوگرافی تمایلی به منظور خالصسازی آلبومین انسانی میباشد. دانه های ساخته شده باید مقاومت مکانیکی و ظرفیت جذب بالا و قابلیت جداسازی راحتتری در مقایسه با آگارز معمولی از محیط تخلیص داشته باشند و پروتئین تخلیص شده توسط آنها، به میزان خلوص قابل قبول در کاربردهای دارویی (خلوص بالای 9/99%) رسیده باشد. ابعاد دانه های آگارز ?m 50 تا 200 میباشد. در ابتدا تأثیر نوع یون (Na+ و Ca2+) و غلظت آن (mM 0، 100 و 200) و حضور ماده فعال سطحی بر اندازه قطرات امولسیون و یکنواختی دانههای آگارز تهیه شده بررسی شد. این موضوع مشخص شد که یکنواختی توزیع اندازه ذرات را میتوان به صورت مستقیم با غلظت یون و نوع یون در فاز آبی کنترل کرد. آنالیز واریانس نشان میدهد که غلظت آگارز، نوع نمک و غلظت آن و حضور ماده فعال سطحی بر روی SV و قطر متوسط توزیع اندازه ذرات تأثیر گذار است. اما حضور ماده فعال سطحی پارامتر کلیدی و مؤثر بر SV توزیع اندازه ذرات می باشد. با افزایش بار یونها در قسمت کنترل اندازه ذرات، توزیع اندازه تخلخل دانهها نیز از میکرو به مزو و ماکرو افزایش می یابد. در مسیری که انتخاب شد برای افزایش مقاومت مکانیکی دانه های آگارز از نانوذرات مغناطیسی آهن، میکروکره های پلیدیوینیلبنزن (PDVB) و میکروکرههای مغناطیسی PDVB استفاده شد. ابتدا تنها نانوذرات مغناطیسی (به مقدار g/ml0/008، 0/016 و 0/024) به دانه های آگارز اضافه شد. این نانوذرات اضافه شده در مقاومت مکانیکی و عملکرد دانه های تمایلی در جذب آلبومین تاثیر مثبت و معنی دار داشتند. نتایج نشان داد که دانه های تهیه شده دارای g/ml 0/024 دارای بیشینه مقدار مغناطش به مقدار emu/g 8، 10 و 12 به ترتیب برای آگارز 4، 6 و 8% می باشد. که این تفاوت در مقدار مغناطش به دلیل دانسیته غلظت بیشتر آگارز پوشش برروی نانو ذرات ایجاد شده است. شار عبوری آب مقطر از بستر پر شده با دانه های آگارز مغناطیسی در مقایسه با معمولی بیشتر می باشد اما دانسیته لیگاند سیباکرون بلو برروی هردو دسته دانه ها با یکدیگر برابر بود. اما تاثیر نانوذرات مغناطیسی بر جهت گیری فضایی پروتئین آلبومین سبب گردید تا مقدار جذب بیشینه بدست آمده از مدل لانگمویر برای دانه های آگارز مغناطیسی بیشتر از دانه های آگارز معمولی باشد. در بخش دوم از بهبود دانه های آگارز، بعد از آبدوست کردن میکروکره های PDVB، لایه آگارز بر روی این دانه¬ها قرار گرفت. به این منظور آگارز را بر روی غلظت های متفاوتی از این میکروذرات (%w/v 0، 3، 4، 5 و 6) پوشش دادیم. با بررسی محتوای آب ذرات و با این هدف که آبدوستی دانه های کامپوزیت آگارز-PDVB تهیه شده کاهش نیابد مقادیر 3 و 4 % وزنی/حجمی از پلیمر برای افزودن به آگارز انتخاب شد زیرا علاوه بر تغییر آبدوستی دانه ها، ساختار شبکه آگارز نیز تحت تاثیر وجود میکروذرات قرار می گیرد. با این درصد غلظت پلیمر مقاومت مکانیکی و شار آب مقطر عبوری از بستر پر شده افزایش یافت. مقدار لیگاند سیباکرون بلو تثبیت شده برروی این دانه های کامپوزیت دو برابر دانه های آگارز و مقدار لیگاند نیکل-ایمینودی استیک اسید بیش از سه برابر دانه های آگارز معمولی بوده است. سپس به منظور کاهش نشت نانوذرات مغناطیسی، پلیمرهای مغناطیسی PDVB با بیشترین مقدار نانوذره ایی باشد که مقدار مغناطش آن نسبت به مقادیر دیگر نانوذره به حالت پلاتو رسیده باشد را تهیه و درون دانه های آگارز کپسوله شد. سپس جذب پروتئین آلبومین انسانی به عنوان پروتئین هدف مورد بررسی قرار گرفته است. سپس فرآیند جذب آلبومین در شرایط بیشینه جذب و به روش‌های ایستا و پویا در محلول خالص پروتئین و همچنین در حالت پویا از محلول سرم خونی صورت گرفت.
- Abstract
- The aim of this study is to prepare four modified agarose beads as affinity adsorbent to use in affinity chromatography in order to purify Human albumin. Prepared beads should have higher mechanical strength, superior adsorption and purification ability to separate easily from environment and purified protein resulted from them should get to an acceptable purity level. Prepared agarose beads are in the range of 50 to 200 ?m. Here, the goal is not to optimize agarose concentration to reach required parameters from beads. First effects of ion type (Na +, Ca2 +) and its concentration (0, 100 and 200 mM) and also the presence of surfactant on emulsion droplet size and uniformity of prepared agarose beads was studied. It was revealed that by increasing ion concentration, span number (SV) which is an indicator of uniform distribution of beads, will decrease. Uniform distribution of beads size can be controlled directly by ion concentration and ion type in aqua phase. Analysis of variance showed that agarose concentration, salt type and concentration and also presence of surfactant are effective on SV and average diameter of particle distribution size. By increasing ion charge in beads controlling section, pore size distribution is increased from micro to meso and macro pores. Then to reach the goal of easily separation fropm environment, in selected procedure, iron magnetic nanoparticles was used. In first section, only magnetic nanoparticles (in amounts of 0.016, 0.008 and 0.024 g/ml) were added to agarose beads. The best magnetic agarose beads in these section was 0.024 g/ml nanoparticle added beads that had 12, 10 and 8 emu/g magnetization for 4, 6 and 8% agarose beads respectively. This difference in magnetization amount is caused due to higher concentration of agarose coating on prepared nanoparticles. Distilled water flow over the bed filled with magnetic agarose is more than normal ones. These added nanoparticles had a significant impact on mechanical strength and performance of affinity particles in albumin absorption.However, Cibacron Blue ligand density is the same for both groups. But, effects of magnetic nanoparticles on the spatial orientation of albumin protein caused more maximum absorption from Langmuir model for magnetic agarose beads than normal beads. In the second section, PDVB micro particles were prepared. Then, agarose layer was put on these particles. In order to do so, 4, 6 and 8% agarose was coated on different concentration of these PDVB microparticles (0, 3, 4, 5and 6% w/v). After analysing particles water content and crystallinity structure, 3 and 4% w/v amount of agarose were chosen and it was noted that both mechanical resistance and water flux through the packed column was increased by these addition. The aim of this selection was to keep hydrophilic characteristic of beads unchanged. It should be noted that if PDVB microparticle concentration was more than 5%, not only particles hydrophilicity, but also agarose structure is affected by microparticles. In addition, Cibacron Blue ligand density for PDVB-agarose composite beads was twice and Ni-IDA ligand density was triple of of regular agarose beads. Then, in order to decrease magnetic nanoparticle leakage, magnetic PDVB were prepared and encapsulated in agarose beads. Prepared magnetic polymers contain maximum nanoparticles which has reached Plateau status for maximum magnetization. Beads with higher mechanical strength and magnetic properties were produced with these magnetic micro particle polymers. Then the absorption of human albumin protein as the target protein was studied. Afterwards, albumin absorption process was done in maximum absorption condition with static and dynamic methods.
