عنوان پایان‌نامه
همسانه سازی و بررسی تنوع ژنتیکی ژن ۲AHP ویروس برگ بادبزنی مو
- رشته تحصیلی
- مهندسی‌کشاورزی-بیماری‌شناسی‌گیاهی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه پردیس ابوریحان شماره ثبت: 933;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 80503;کتابخانه پردیس ابوریحان شماره ثبت: 933;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 80503
- تاریخ دفاع
- ۲۸ شهریور ۱۳۹۵
- دانشجو
- مرضیه انتشاری
- استاد راهنما
- شاهین نوری نژادزرقانی
- چکیده
- ویروس برگ باد بزنی مو (Grapevine fanleaf virus, GFLV) یکی از مخرب ترین ویروس های بیماری زای انگور است که باعث افت محصول در تاکستان‌های ایران نیز می شود. این ویروس سه گروه از علایم شامل برگ بادبزنی، موزاییک زرد و رگ نواری را در مو ایجاد می کند. شدت علایم ایجاد شده توسط این ویروس به جدایه‌ی ویروس، حساسیت رقم انگور و شرایط محیطی بستگی دارد. ژنوم این ویروس از دو مولکول RNAی تک لا با قطبیت مثبت تشکیل شده است که هر یک پلی پروتئین بزرگی را رمز می کنند. پلی پروتئین رمز شده از RNA2 به سه پروتئین کوچکتر 2AHP، 2BMP (پروتئین حرکتی ویروس) و 2CCP (پروتئین پوششی ویروس) هضم می شود. بر اساس مقایسه توالی RNA2 جدایه های GFLV نشان داده شده است که تنوع جدایه های این ویروس در ناحیه ژنومی 2AHP بیشتر از سایر بخش های RNA2 است و شاید تنوع این ژن با علایم متنوع ایجاد شده مرتبط باشد. هرچند نشان داده شده است که این ژن در تکثیر RNA2 ویروس به همراه سایر پروتئین های رمز شده از RNA1 دخیل است ولی نقش یا نقش های دقیق ژن 2AHP معلوم نیست. اولین گام برای بررسی نقش یک ژن جداسازی و همسانه سازی آن ژن است. از این رو برای بررسی ژن 2AHP در ویروس برگ بادبزنی مو آغازگرهایی برای جداسازی و تکثیر این ژن طراحی شدند تا با تکثیر این ژن، گام نخست برای مطالعات بعدی برداشته شود. از آنجا که علایم مختلف ناشی از این ویروس به تنوع ژنوم ویروس در ناحیه 2AHP نیز نسبت داده شده است، از این رو سعی شد در این تحقیق تنوع ژنتیکی جدایه های GFLV در این ناحیه ژنومی و در دو گروه از علایم موزاییک زرد و رگ نواری (با تاکید بیشتر بر موزاییک زرد) بررسی شوند. برای این منظور نمونه‌برداری از تاکستان‌های بناب، ملکان، روستای شیرامین، حسین آباد قزوین، اصفهان و تبریز جمع آوری و با استفاده از آزمون‌های سرولوژیکی DAS-ELISA نمونه‌های آلوده مشخص شدند. سپس واکنش زنجیره ای پلیمراز معکوس و با بکارگیری آغازگرهای اختصاصی طراحی شده، ژن 2AHP تکثیر گردید و پس از آن، محصولات RT-PCR به حامل همسانه سازی pTG19-T متصل گردیدند. پلاسمیدهای نوترکیب پس از انتقال و تکثیر در باکتری Escherchia coli استخراج و توسط شرکت ماکروژن کره جنوبی تعیین توالی شدند. ترادف نوکلئوتیدی ژن 2AHP جدایه‌های مورد بررسی با دیگر جدایه‌های این ویروس از سایر نقاط جهان، مقایسه شدند. نتایج حاصل از تعیین توالی، وجود GFLV و نیز صحت تکثیر ژن 2AHP را تایید نمود. . بر اساس اندازه ی ژن 2AHP جدایه‌های ایرانی GFLV در چهار گروه با اندازه متفاوت شامل 771 ، 774 ،777و 798 نوکلئوتید تقسیم شدند. میزان تنوع ژنتیکی مشاهده شده در بین جدایه های ایرانی 19/9 و 23 درصد به ترتیب در سطح اسیدهای نوکلئیک و اسیدهای آمینه بود. میزان تنوع این ژن39 % درصد در سطح اسیدهای نوکلئیک و اسیدهای آمینه گزارش شده بود که در این مطالعه مشخص شد تنوع این ژن بیشتر بوده و به ترتیب 31/2 و 33/5 درصد است. درخت فیلوژنی ترسیم شده براساس ژن 2AHP در سطح توالی نوکلئوتیدی به روش ماکسیمم پارسیمونی نشان داد که تمامی جدایه های GFLV در 13 گروه دسته‌بندی شدند. جدایه های ایرانی در دو گروه شامل جدایه‌های Shir Amin-10، Shir Amin و Urmia و گروه دیگر شامل Shir Amin-01،Shir Amin-12 ،Shir Amin-06 ، Takestan-2، Bonab-2،Tabriz-1، و Malekanقرار گرفتند. نتایج نوترکیبی، نشان دهنده عدم وجود پدیده نوترکیبی بین جدایه‌های مورد بررسی بود، اما داده های حاصل از آنالیزهای نوترکیبی گزارش شده را تایید نمود. فشار انتخابی وارد بر ژن 2AHP نیز محاسبه شد که بیانگر فشار انتخابی منفی حاکم بر روی این ژن بود، ولی میزان این فشار در تمامی بخش های این ژن یکسان نبود، بطوریکه انتهای آمینی 2AHP متناظر با نوکلئوتیدهای 564-408 بر اساس جدایه GFLV-F13 بیشتر از یک بود.
- Abstract
- Grapevine fan leaf virus (GFLV) is one of the most destructive viruses in grapevines which have been also reported from Iran. GFLV expresses different symptoms ranging from fanleaf, yellow mosaic, and vein banding syndromes. The severity of symptoms depends on genetic diversity of the virus genome, susceptibility of host variety and environments. Genome of GFLV consists of two single stranded positive senses RNA molecules (RNA1 and RNA 2) in which codes for a two polyproteins (P1 and P2). The polyprotein P2 is digested to three functional proteins designated by 2AHP (homing protein), 2BMP (movement protein) and 2CCP (coat protein). Pairwise comparisons of available sequences for GFLV RNA2s showed that the first part of RNA2 according to the 2AHP region is the most variable part of the RNA2. Therefore, it has been proposed that this region could be involved in symptom determinants. However, it has been shown that the 2AHP protein is involved in RNA2 replication in cooperation with RNA1 encoded proteins, the exact role(s) of this gene or its protein is unclear. First step in studying a gene function is its isolation. Thus, in the present study, cloning of 2AHP gene of GFLV isolates was concerned. To do this end, we tried to design and introduce specific primers for amplification of the 2AHP gene for downstream studies. On the other hand, some isolates of GFLV express yellow mosaic symptoms in spring while others express vein banding in late spring and summer in grapevines. Thus, the aim of this study was evaluation of genetic diversity of GFLV isolates within and between similar syndromes based on 2AHP gene. Therefore leaf samples expressing GFLV symptoms were collected from vineyards of Takestan, Bonab, Shir-Amin, Hohesin-Abad, Malekan, Isfahan, and Tabriz. Infectivity of the samples to GFLV was assessed by DAS-ELISA test.Using specific antibodies the efficacy of designed in which primers was assessed in reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and three pairs of primer them successfully amplified the GFLV 2AHP gene in selected samples. RT-PCR products were ligated into T/A cloning vector, pTG19-T (Vivantis, Malaysia) and then introduced to Escherichia coli. Selected recombinant plasmids were sequenced by Macrogen( South Kurea). The sequence data confirmed right cloning and isolation of GFLV 2AHP gene. The 2AHP gene isolated from GFLV infected samples ranging from 771 to 798 nucleutidein size, so they could be divided in 4 groups based on length. Phylogenetic tree showed GFLV isolates were placed in 13 groups in which Iranian isolates were placed in three groups. A recombination analysis was not detecting new events while confirmed the previous events The 2AHP gene was under negative selection pressure, but it was not uniformly distribut on all parts of the gene in which N-terminal of 2AHP according to nucleotides 408-564 was more than one. Keywords: Grapevine, Nepovirus, yellow mosaic, phylogeny, cloning, RT-PCR, Sequencing.
